Een Screenbare<em> In Vivo</em> Test voor Mitochondriale Modulators gebruik van Transgene Bioluminescent<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.
Abstract
The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode’s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.
Introduction
Het algemene doel van deze procedure is de snelle kwantificering van de energiestatus van C. elegans in vivo teneinde dit als een eindpunt in samengestelde screening. De grondgedachte is gebaseerd op de transgene expressie van vuurvlieg luciferase in de nematode C. elegans 1-3 via het plasmide pSLGCV (1 https://www.addgene.org/49862). Het luciferase-enzym wordt gefuseerd met het groen fluorescent eiwit GFP en constitutief en alomtegenwoordig tot expressie gebracht in het cytoplasma (de luciferase peroxisoom targeting signaal werd verwijderd). Dit leidt tot lichtemissie wanneer het substraat luciferine exogeen wordt geleverd. Omdat de worm transparant, licht kan worden gemeten in een luminometer als relatieve lichteenheden (RLU). Cellulaire ATP brandstoffen de bioluminescentie reactie en de beschikbaarheid bepaalt de lichtniveaus geproduceerd. Bijgevolg luminometrie biedt convenient betekent het beoordelen van de relatieve ATP niveaus en bij uitbreiding de mitochondriale functie, omdat ATP productie vindt voornamelijk plaats in de mitochondriën. Een koppeling tussen de mitochondriale functie en bioluminescentie niveau is al eerder aangetoond door de silencing van mitochondriale elektronen transportketen genen en daarmee gepaard gaande verminderde lichtopbrengst. 1
De bioluminescentie stammen gegenereerd werden aangeduid PE254 (feIs4) en PE255 (feIs5) 1 (zie lijst materialen) en kan onderling uitwisselbaar. 3 een aantal studies deze sensor stammen gebruikt om verslag cellulaire ATP-niveaus in vivo na blootstelling aan verschillende lichaamsvreemde stoffen zoals natriumazide 1, cadmium 2, rioolwater slib extract 3, 5'-fluor-2-deoxyuridine 6 en een tabak-specifieke nitrosamine 7. De stammen zijn ook nuttig om de effecten van blootstelling aan ultraviolette straling monitoren C <sup> 8 en de effecten van het verstoren van de mitochondriale ademhalingsketen functie. 1,9 Een vroege versie van de luminescentie sensor expressie van het luciferasegen zonder GFP-fusie (PO39) is ook gebruikt bij het onderzoek van de effecten van zware metalen en een respiratoire . ontkoppelrail 10 Stammen PE254 en PE255 dragen de luciferase: GFP fusie en GFP fluorescentie bleek proportioneel toenemen met nematode massa, het aanbieden van een geschikt middel voor de normalisering van de luminescentie waarden 6,9 De effecten van differentiële hoeveelheid wormen per putje kan ook. door het opnemen van meerdere technische replicaten in de assay (minimaal 5 putjes per conditie) meegenomen. 3
Het protocol biedt de mogelijkheid om in vivo opvolging van energieniveaus (in tegenstelling tot technisch bewerkelijke in vitro ATP bepalingen) waardoor verbinding screening en herpositionering in de fysiologische context van een hele multicellular organisme. De procedure kan worden uitgebreid tot verschillende genetische achtergronden door het kruisen van het geïntegreerde transgen in chromosomaal beschikbare mutante stammen en / of silencing genen door RNA interferentie; dus, het optimaal gebruik maken van C. elegans als modelorganisme. De methode moet helpen verminderen late fase falen van kandidaat-geneesmiddelen als gevolg van mitochondriale toxiciteit en een bijdrage leveren aan vermindering van de hogere dierproeven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het modelorganisme C. elegans een krachtige experimentele systeem. Het is gemakkelijk te kweken en vormt overvloedige genetisch identieke nakomelingen met 3,5 dag levenscyclus van ei tot reproduceren volwassene (via juveniele larvenstadia L1 tot L4). Vanwege zijn geringe omvang kan gemakkelijk worden gekweekt in 96-putjes platen, vergemakkelijkt compound screening. We presenteren een fenotypische screening protocol gebaseerd op stammen van C. elegans die als in vivo sensoren energieniveaus. 14 Het protocol is toepasbaar op elk laboratorium, hoewel een 96-wells plaat luminometer en een steriele kast vereist. Het is belangrijk om besmetting in testen voorkomen door goede laboratoriumtechniek. Als handmatig werken, het maximum aantal nematode platen haalbaar is 13 per experiment waardoor het testen van 2x 96-well platen drug en met twee voertuigen platen. Representatieve resultaten gepresenteerd voor het mitochondriale complex I inhibitor rotenone, de superoxide generator paraquat, de citroenzuurcyclus tussenliggende oxaloacetaat en vier verbindingen met bekende vuurvliegluciferase remmende activiteit. De eerste twee verbindingen tot een afname van bioluminescentie zoals voorspeld dat oxaalacetaat leidde tot een verbetering, waarschijnlijk veroorzaakt door een grotere productie van ATP. De oxaloacetaat datasets tonen ook aan de intrinsieke variabiliteit in experimenten gebaseerd op vuurvliegluciferase als verslaggever. Een minimum van drie onafhankelijke experimenten raadzaam robuustheid van de reacties te bepalen onbekende verbindingen.
Remming van vuurvlieg luciferase-activiteit werd geïdentificeerd met een in vitro assay met behulp van een commerciële kit. 3 Eén van de verbindingen resulteerde in een aanzienlijke toename van GFP-fluorescentie in overeenstemming met de remmer verhoging van het niveau van GFP-gelabeld vuurvliegluciferase door binding aan het luciferase enzym actief site, en waardoor het stabieler. 15 In sommige gevallen(niet in dit geval) kan leiden tot verhoogde bioluminescentie als de remmer wordt verplaatst overmaat ondergrond. 15 Het is daarom belangrijk geen resultaten foutief interpreteren van verbindingen die interageren met het firefly enzym een verminderde of verhoogde ATP niveaus / mitochondriale functie. Veranderingen in luminescentiesignaal vaak correleren met aanvullende metingen van gezondheid, zoals beweging, ontwikkeling en groei. Als voorbeeld, een verbinding een verdacht luciferase-inhibitor als een dramatische daling bioluminescentie signaal wordt gedetecteerd maar wormen te onderscheiden van de controles door microscopische waarneming. Een toename van GFP-fluorescentie, niet verklaard door groei of samengestelde autofluorescentie kan ook wijzen op een remmer. Een aantal van de luciferase-remmers 15 zijn bekend en hebben in PubChem ingevoerd. Daarom is in de eerste plaats, het is een goede gewoonte om informatie over luciferase remmers gehouden door PubChem raadplegen; gevolgd door tressant van de verbinding effecten bij in vitro assays met gezuiverd enzym 3 en / of bevestiging van effecten op de mitochondriale functie door additionele middelen. 16,17
GFP fluorescentie metingen kan de detectie van vuurvlieg luciferase niveaus (en de mogelijke opsporing van bepaalde luciferase-enzym inhibitoren als hierboven besproken) die sterk voor het meten van dit eindpunt samen bioluminescentie indien mogelijk. Normalisatie van bioluminescentie metingen aan GFP is ook een middel voor de boekhouding van variaties in worm getallen tussen wells (hoewel dit kan ook worden bereikt door opname van meerdere technische replicaten). Voor grotere gevoeligheid, is het belangrijk om achtergrondfluorescentie aftrekken metingen. Het protocol beoordeelt bijdrage van de bacteriële suspensie naar de achtergrond fluorescentie echter nematode autofluorescentie is niet goed voor (een beperking van de huidige test, bijzonder kritisch voor een vergrijzende stusterft omdat nematode autofluorescentie toeneemt met de leeftijd). Autofluorescentie van testverbindingen moet ook worden onderzocht in parallel. GFP normalisering zou noodzakelijk lijkt waar onderzoekers willen protocol passen aan cellulaire ATP pools te vergelijken in verschillende genetische mutanten of na silencing van verschillende genen, om te controleren voor enige stam verschillen op het niveau van expressie van het transgen bioluminescentie.
Kritische parameters in de protocollen zijn ontwikkelingsstadium waarin belichting wordt geïnitieerd, de duur van de blootstelling, en het verkrijgen van vergelijkbare aantallen nematoden in verschillende putjes. Blootstelling kan beginnen in elk stadium van de ontwikkeling van de aaltjes, maar L3 podium of ouder is de voorkeur. Vanaf deze fase op, nematoden is afhankelijk van oxidatieve fosforylering voor de ontwikkeling naar volwassenheid, zoals blijkt uit een significante toename van de mtDNA inhoud, zuurstofverbruik en ATP niveaus. 18,19,20 De huidige protocol initieert expoure in het L4 stadium. De reden aliquoting nematoden tot 96-well platen enkel in dit stadium (niet wanneer zij voor het eerst werden voorzien van voedsel in de L1 fase), is dat hoewel platen in vochtige kamers worden geplaatst om verdamping te minimaliseren, een mate van verdamping komt nog in onze schudincubator, gezien als zeer kleine druppels die op de deksels (kan dit geen probleem met andere schudden incubators zijn). Door aliquoting nematoden platen vlak voor toevoeging van het geneesmiddel normen, is de feitelijke concentratie geneesmiddel los van eventuele kleine variatie in volume door verdamping. Het laden van een nematode bord met het voertuig alleen nuttig is om te controleren of nematoden gelijkmatig verdeeld tussen de putten. Elke significante verschillen gevonden voor het voertuig alleen plaat zou een indicatie van een slechte techniek in het afgeven van de nematoden te putten.
De duur van de blootstelling is een belangrijke factor om te overwegen. Als effecten op energie-status, onafhankelijk van de groei zijn van belang, het protocol kan worden aangepast om kortere blootstelling (van bijna onmiddellijke reactie op bijvoorbeeld 2 uur) plaats. Anderzijds, toegang van verbindingen in C. elegans weefsels kan enige tijd duren. Bijvoorbeeld 12-24 uur moeten maximumcapaciteit concentraties resveratrol en 5-fluor-2'-deoxyuridine (FUDR) bereiken. 21 daarom een langere blootstelling (18 tot 24 uur) kan gerechtvaardigd blootstelling maximaliseren. De belichtingstijd te beperken tot tijden die niet toestaan dat aanzienlijke niveaus van voortplanting plaatsvinden in de put. Wij bevelen aan dat de totale ontwikkelingstijd van nematoden onder 66-67 uur wordt gehouden. Hoewel handig, worden nematoden gravid door toen en eileggen hebben geopend. Toch vonden we bioluminescentie lezingen uit ei voorbereidingen verwaarloosbaar (niet getoond). The sur 5-promoter gedreven transgenexpressie wordt eerst gedetecteerd slechts 2-2 en een half uur na de bevruchting op 100 cellig stadium 22 en de chitinous eierschaal is waarschijnlijk ingang van luciferine beperken. Anderen hebben echter gevonden dat bebroede eieren die niet significant bijdragen aan het metabolisme van zwangere volwassenen. 23, omstandigheden die aanzienlijke nageslacht productie te vermijden. Indien gewenst, kan de experimentele tijdschaal worden verschoven terug: we hebben eerder gestart blootstelling aan een milieu-toxine in de late L3 larvale stadium (36 uur) en bioluminescentie en GFP metingen bij 55 uur uitgevoerd 2 alternatief genetische achtergronden die zijn voorwaardelijk steriel. kan worden gebruikt voor de productie van nakomelingen te voorkomen, bijvoorbeeld de fer-15 (B16) II; fem-1 (hc17) IV dubbele mutant die bij 15 ° C kan worden gehandhaafd, maar steriel bij 25 ° C. 24 Het gebruik van FUDR steriliteit induceren wordt niet aanbevolen, omdat dit kan op zichzelf invloed nematode metabolisme. 25 De test kan ook worden uitgevoerd in stammen met meer doorlaatbaar nagelriemen zoals gedeeltelijk verlies-van-function bus-8 mutanten die multidrug-gevoelig vanwege permeabiliteit van geneesmiddelen te verhogen. 26 zijn deze korter blootstelling en lagere concentraties verbinding te vergemakkelijken. De voorwaarden voor het toevoegen van luciferine deze nematoden ook moeten aanpassen namelijk 1% DMSO en 0,05% Triton-X100 in de luminescentie buffer niet verplicht luciferine beschikbaarheid te verbeteren.
Het protocol maakt gebruik van 1% DMSO als vehikel voor aflevering verbinding. Hoewel niet dodelijk, deze concentratie van DMSO heeft een aantal biologische effecten als we in een eerdere publicatie besproken. 3 Veel van de beschikbare geneesmiddelen bibliotheken worden bereid in 100% DMSO in concentraties die geschikt zijn voor cel-gebaseerde testen zullen na verdunning voertuig tot 0,1%. Hogere concentraties verbinding vereist om responsen opwekken in C. elegans vergelijking met humane cellen, zodanig dat het vaak niet mogelijk is om assays te voeren bij minder dan 1% DMSO. Ook het gebruik van stammen metmeer doorlaatbaar nagelriemen kan leiden tot het testen met lagere concentraties van het voertuig. Concentraties van DMSO meer dan 1% worden niet aanbevolen.
Een set incubatietijd met luciferine voorafgaand aan de metingen moeten worden nageleefd. Zoals eerder aangetoond, luminescentie bereikt zijn maximale niveaus in de tweede minuut na toevoeging van luciferine, die betrekkelijk stabiel voor de eerste 5 min, gevolgd door een langzame geleidelijke afname van de luminescentie in de volgende 30 min 1. Kinetic antwoorden op een bepaalde chemische stof kan tijdens deze eerste fase van 30 minuten na de eerste dosering van luciferine uitgevoerd.
Het protocol omvat een hongerdood stap na collectie van eieren om de synchronisatie van de nematode bevolking te bereiken. We raden synchronisatie van nematode testen populatie sinds verschillende ontwikkelingsstadia verschillen in cellulaire ATP-niveaus en kunnen anders reageren op de proef verbindingen. Door het uitvoeren van de hongersnood in de S compleetmedium tegenstelling tot M9 worden de arcering nematoden voorzien van een koolstofbron (ethanol), zodat larven niet ontwikkelen, maar niet volledig uitgehongerd. 27,28 Ook is aangetoond dat L1 aangehouden worden klaar voor snelle respons op voedsel en L1 normale groeisnelheid wordt binnen 3 uur na de maaltijd beschikbaar. 29 echter de mogelijkheid dat de honger stap het metabolisme van C. kunnen veranderen elegans kan niet worden uitgesloten. 30 Daarom is de lengte van de honger mag niet hoger zijn dan 24 uur (18 uur voldoende is voor synchronisatie). Bepaalde laboratoria de mogelijkheid om een Copas Biosorter voor leeftijd synchronisatie omzeilen van de honger stap geheel hebben. Andere laboratoria kunnen een voorkeur voor het uitbreiden van de nematode populatie op vaste media (NGM platen met OP50) voorafgaand aan het bleken (stap 3.1) en dit zal ook goed werken. We maken gebruik van S medium tijdens blootstelling verbinding als een standaard medium voor nematode kweken, however andere media kunnen worden geselecteerd, bijvoorbeeld K medium of EPA matig hard water worden vaak gebruikt voor ecotoxicologische studies. 31,32
Het protocol biedt de mogelijkheid om het scherm en de kandidaten voor verdere testen op het vlak van de effecten op de mitochondriale functie te identificeren. In het stadium van de primaire screening is het waarschijnlijk dat sommige verbindingen zullen zijn gemist als gevolg van één concentratie getest derhalve drug schermen zijn niet volledig beschouwd. Treffers kan worden gevalideerd door het gebruik van technieken voor het beoordelen van de verschillende aspecten van de mitochondriale functie zoals zuurstofverbruik, C. elegans stammen met GFP tot expressie mitochondria, vlekken voor mitochondriële membraanpotentiaal en / of ROS metingen. 16,33,34 Het grootste belang van de methode is een middel hebben voor het screenen groot aantal verbindingen en / of omstandigheden bij de meercellige organismale niveau en belangrijker om te kunnen profiteren van the genetische volgzaamheid van C. elegans om werkingsmechanismen te onderzoeken. De techniek kan helpen versnellen en nieuwe routes naar de ontdekking van interessante verbindingen en targets. Verwacht wordt dat de combinatie van de sensor met genetische achtergronden geassocieerd met humane ziekte screening van bibliotheken van verbindingen in een ziekte relevante context veel te bieden hebben.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.
Materials
| Orion II Microplate Luminometer | Berthold Detection Systems | with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| FLx800 fluorimeter | Biotek | with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| Ks 130 basic shaking platform | Ika | #0002980000 | |
| Innova 4349 | New Brunswick Scientific | Refrigerated incubator shaker | |
| Eppendorf centrifuge 5804R | Eppendorf | with eppendorf rotor A-4-44 (for 50/15ml tubes) | |
| Stripette, Costar | Corning | #4489 | Serological pipette |
| Cellstar 50 ml tubes | Greiner bio-one | #227661 | |
| Cellstar 15 ml tubes | Greiner bio-one | #188261 | |
| Cellstar 60 mm tissue culture plates | Greiner bio-one | #628160 | |
| Superfrost Microscope slides | VWR | #631-0909 | |
| Sterile spatula | Corning | #3007; #3004 | for weighing out chemicals |
| 0.22 mM Millex GP filters | Millipore | #SLGP033RS | |
| Axygen eppendorf tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | #MCT-150-R | |
| Corning 96 well assay plate | VWR | #3603 | Black plate clear bottom with lid |
| Nunc 96 well assay plate | Fisher Scientific | #236105 | White plate with lid |
| Reservoir reagent 60 mL | Thermo Scientific Finnpipette | #9510027 | used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1) |
| Storage box/damp chamber | Roche Diagnostics | #10 800 058 001 | 174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid |
| Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content | Sigma Aldrich | #239305 | Store in aliquots at 4°C, seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil |
| D-Luciferin, potassium salt | Biotium Inc | # 10101-2 | Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | # P9416 | |
| DMSO | CalBiochem | #317275 | Purity 99.99% |
| Triton X100 | Alfa Aesar | #A16046 | Diltute to 10% in ddH20 |
| Nystatin | CalBiochem | #475914 | |
| C. elegans bioluminescent strains | Author's own laboratory | PE254, PE255 | contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then. |
| E. coli OP50 | CGC | ||
| General chemicals | Sigma Aldrich/Fisher Scientific |
References
- Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans. BMC Physiol. 8, 7 (2008).
- Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor. Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).
- McLaggan, D., et al. Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor. PloS one. 7, e46503 (2012).
- Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells. Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).
- Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5′-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
- Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans. Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).
- Leung, M. C., et al. Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).
- Kuang, J. J., Ebert, P. R. The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism. Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).
- Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors. FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Brenk, R., et al. Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases. ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).
- Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. . Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).
- Thorne, N., et al. Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter. Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).
- Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497, 451-457 (2013).
- Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Pharmacological approaches to restore mitochondrial function. Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).
- Tsang, W. Y., Lemire, B. D. Mitochondrial genome content is regulated during nematode development. Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).
- Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans. Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).
- Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
- Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods. PloS one. 8, e56877 (2013).
- Yochem, J., Gu, T., Han, M. A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis. Genetics. 149, 1323-1334 (1998).
- Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans. J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, 1101-1112 (2002).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev Biol. 317, 549-559 (2008).
- Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae. PloS one. 7, (2012).
- Baugh, L. R. To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest. Genetics. 194, 539-555 (2013).
- Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest. Science. 324, 92-94 (2009).
- Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans. Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).
- Cressman, C. P., Williams, P. L. Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media. Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).
- Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media. Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).
- Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response. Genetics. 174, 229-239 (2006).
- Yang, W., Hekimi, S. A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans. Plos Biol. 8, (2010).
