Un Screenable<em> In Vivo</em> Saggio per mitocondriale modulatori Uso Transgenic Bioluminescent<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.
Abstract
The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode’s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.
Introduction
Lo scopo generale di questa procedura è la quantificazione rapida dello stato energetico di C. elegans in vivo, al fine di utilizzare questo come un endpoint screening composti. Il razionale si basa sull'espressione della luciferasi di lucciola transgenica nel nematode C. elegans 1-3 tramite il plasmide pSLGCV (1 https://www.addgene.org/49862). L'enzima luciferasi è fusa alla proteina fluorescente GFP verde e si esprime costitutivamente e ubiquitariamente nel citoplasma (perossisoma luciferasi segnale di targeting è stato rimosso). Questo porta ad emissione di luce quando il substrato luciferina è fornito esogenamente. Come il verme è trasparente, la luce può essere misurata in un luminometro come unità di luce relativa (RLU). Combustibili ATP cellulare la reazione bioluminescenza e la sua disponibilità determina i livelli di luce prodotte. Di conseguenza, luminometria offre un convenient significa valutare livelli di ATP relativi e per estensione la funzione mitocondriale, dal momento che la produzione di ATP si verifica principalmente nei mitocondri. Un legame tra i livelli di funzione e bioluminescenza mitocondriale è stata dimostrata in precedenza attraverso il silenziamento di geni mitocondriali catena di trasporto degli elettroni e concomitante emissione luminosa ridotta. 1
I ceppi bioluminescenza generati sono stati designati PE254 (feIs4) e PE255 (feIs5) 1 (vedi elenco dei materiali) e può essere usato in modo intercambiabile. 3 Una serie di studi hanno utilizzato questi ceppi di sensori a riferire sui livelli di ATP cellulare in vivo in seguito all'esposizione a varie sostanze chimiche xenobiotici come l'azoturo di sodio 1, cadmio 2, delle acque reflue estratto fanghi 3, 5'-fluoro-2-deossiuridina 6, e un nitrosamine specifiche del tabacco 7. Le tensioni sono state anche utili per monitorare gli effetti dell'esposizione a radiazione ultravioletta C <sup> 8 e gli effetti di interruzione della funzione respiratoria mitocondriale. catena di 1,9 Una prima versione del sensore di luminescenza che esprime il gene della luciferasi, senza una fusione GFP (PE39) è stato usato anche nella ricerca di effetti di metalli pesanti e di una delle vie respiratorie . sganciamento 10 ceppi PE254 PE255 e portare la luciferasi: GFP fusione e fluorescenza GFP ha mostrato di aumentare proporzionalmente con la massa nematode, che offre un mezzo conveniente per la normalizzazione dei valori di luminescenza 6,9 Gli effetti di importo differenziale di vermi per bene possono anche essere. preso in considerazione includendo più replicati tecnici nel test (un minimo di 5 pozzi per condizione). 3
Il protocollo offre la possibilità di monitorare in vivo dei livelli di energia (in contrapposizione alla più tecnicamente laboriosa in vitro determinazioni ATP) consente di screening composto e riposizionamento nel contesto fisiologico di un intero muorganismo lticellular. La procedura può essere estesa ad una varietà di ambienti genetici attraversando il transgene cromosomicamente integrato in disponibili ceppi mutanti e / o mettendo a tacere i geni di RNA interferenza; in tal modo, sfruttando appieno C. elegans come organismo modello. Il metodo dovrebbe aiutare a ridurre il fallimento fase tardiva di farmaci candidati a causa di tossicità mitocondriale e dare un contributo alla riduzione della sperimentazione animale superiore.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'organismo modello C. elegans fornisce un potente sistema sperimentale. E 'facile da cultura e produce abbondante prole geneticamente identico ad un ciclo di vita di 3,5 giorni da uovo ad adulto riprodurre (via fasi larvali giovanili L1 fino alla L4). Grazie alle sue ridotte dimensioni, può essere coltivata facilmente in piastre a 96 pozzetti, facilitando lo screening composto. Vi presentiamo un protocollo di screening fenotipico sulla base di ceppi di C. elegans che fungono da sensori in vivo dei livelli di energia. 14 Il protocollo è applicabile a qualsiasi laboratorio, anche se è necessario un luminometro piastra a 96 pozzetti e un armadio sterile. È importante prevenire la contaminazione in saggi utilizzando buona tecnica di laboratorio. Se si opera manualmente, il numero massimo di lastre nematodi ottenibile è 13 per esperimento permettendo la sperimentazione di droga 2x piastre da 96 pozzetti e comprendente due piastre veicolo. I risultati rappresentativi sono presentati per il complesso I mitocondriale inibitore rotenone, il generatore paraquat superossido, il ciclo dell'acido citrico ossalacetato intermedio e quattro composti con nota attività inibitoria lucciola luciferasi. I primi due composti hanno portato ad una diminuzione della bioluminescenza come previsto, mentre ossalacetato ha portato ad un miglioramento, che può derivare dalla maggiore produzione di ATP. I set di dati ossalacetato dimostrano anche la variabilità intrinseca in esperimenti sulla base di luciferasi di lucciola come reporter. Un minimo di tre esperimenti indipendenti sono consigliabili per accertare la robustezza delle risposte ai composti sconosciuti.
Inibizione dell'attività lucciola luciferasi era identificabile con un metodo in vitro utilizzando un kit commerciale. 3 Uno dei composti determinato un notevole aumento fluorescenza GFP coerente con l'inibitore aumentare i livelli di GFP-tag lucciola luciferasi legandosi all'enzima di luciferasi attiva sito, e rendendolo più stabile. 15 In alcuni casi(non in questo caso particolare) ciò può portare ad un aumento dei livelli di bioluminescenza quando l'inibitore viene spostato da eccesso di substrato. 15 è, quindi, importante non interpretare i risultati erroneamente da composti che interagiscono con l'enzima lucciola come diminuzione o aumento dei livelli di ATP / funzione mitocondriale. Le variazioni del segnale di luminescenza molto spesso sono correlate con le misure aggiuntive di salute come il movimento, sviluppo e crescita. Come esempio, un composto è un inibitore luciferasi indagato se viene rilevato un drastico calo segnale bioluminescenza ma vermi sono indistinguibili dai controlli di osservazione microscopica. Un aumento di fluorescenza GFP, non spiegato dalla crescita o autofluorescenza composto, può anche puntare a un inibitore. Un certo numero di inibitori luciferasi 15 sono noti e sono stati inseriti in PubChem. Pertanto, in prima istanza, è buona norma consultare le informazioni sugli inibitori luciferasi detenuti da PubChem; seguito da tressante degli effetti composti in test in vitro con l'enzima purificato 3 e / o la conferma degli effetti sulla funzione mitocondriale con mezzi supplementari. 16,17
Misure GFP fluorescenza consentono il rilevamento di livelli di luciferasi lucciola (e il potenziale rilevamento di alcuni inibitori enzimatici luciferasi come discusso sopra) facendo un forte caso per misurare questo endpoint accanto bioluminescenza, ove possibile. Normalizzazione delle letture bioluminescenza per GFP è anche un mezzo di contabilizzazione delle variazioni di numeri senza fine tra i pozzi (anche se questo può essere ottenuto anche con l'inclusione di molteplici replicati tecnici). Per una maggiore sensibilità, è importante per sottrarre fluorescenza di fondo dalle letture. Il protocollo valuta contributo della sospensione batterica alla fluorescenza di fondo, tuttavia nematode autofluorescenza non è rappresentato (una limitazione del test corrente, particolarmente critico per qualsiasi stu invecchiamentomuore dato che i nematodi autofluorescenza aumenta con l'età). Autofluorescenza di composti in esame dovrebbe essere valutata anche in parallelo. GFP normalizzazione sembrerebbe indispensabile dove i ricercatori desiderano adattarsi protocollo di confrontare piscine ATP cellulari in diversi mutanti genetici o dopo silenziamento di geni diversi, al fine di controllare eventuali differenze di deformazione a livello di espressione del transgene bioluminescenza.
I parametri critici all'interno del protocollo includono lo stadio di sviluppo in cui viene iniziata l'esposizione, la durata dell'esposizione, e ottenendo un numero simile di nematodi nei diversi pozzetti. L'esposizione può iniziare in qualsiasi stadio di sviluppo dei nematodi, tuttavia fase L3 o più è preferibile. Da questo punto in poi, nematodi dipendono fosforilazione ossidativa per lo sviluppo in età adulta, come evidenziato da un aumento molto significativo contenuto di mtDNA, consumo di ossigeno e livelli di ATP. 18,19,20 L'attuale protocollo avvia manifestazioniUre allo stadio L4. La ragione per aliquotando nematodi a piastre da 96 pozzetti solo in questa fase (piuttosto che quando sono stati forniti con il cibo alla fase L1), è che anche se le piastre sono posti in camere umide per minimizzare l'evaporazione, un grado di evaporazione avviene ancora in il nostro incubatore agitazione, visto come molto piccole gocce formano sui coperchi (questo potrebbe non essere un problema con altri incubatori tremanti). Aliquotandolo nematodi a piastre appena prima dell'aggiunta standard droga, la concentrazione effettiva di farmaco non è influenzata da qualsiasi piccola variazione di volume per evaporazione. Caricamento di una piastra nematode con veicolo è utile solo per controllare che i nematodi sono stati equamente distribuiti tra i pozzetti. Eventuali differenze significative trovati per il veicolo unico piatto sarebbe indicativo di scarsa tecnica nel dispensare i nematodi a pozzetti.
La durata dell'esposizione è un fattore importante da considerare. Se gli effetti sullo stato di energia indipendente della crescita sono di interesse, proprotocollo può essere modificato per ospitare esposizioni più brevi (da risposte quasi immediate a, per esempio, 2 hr). D'altra parte, l'ingresso di composti in C. tessuti elegans possono richiedere un certo tempo. Per esempio 12-24 ore sono tenuti a raggiungere concentrazioni interne massime di resveratrolo e 5-fluoro-2'-deossiuridina (FUDR). 21 Di conseguenza, di un'esposizione più lunga (da 18 a 24 ore) può essere giustificabile per massimizzare i livelli di esposizione. Il tempo di esposizione deve essere limitata a volte che non permettono livelli significativi di riproduzione avvengano nel pozzo. Si raccomanda che il tempo di sviluppo totale di nematodi è tenuta sotto 66-67 ore. Anche se conveniente, nematodi sono gravida da allora e hanno avviato egglaying. Tuttavia abbiamo trovato letture bioluminescenza da preparazioni a base di uova trascurabile (non mostrato). L'espressione del transgene guidato sur-5 promotore viene dapprima rilevata solo due a due ore e mezzo dopo la fecondazione nella fase 100 cella 22 ed il cguscio d'uovo hitinous rischia di limitare l'ingresso di luciferina. Altri hanno trovato che le uova embrionate non hanno contribuito in modo significativo al metabolismo degli adulti gravido. 23 Tuttavia, le condizioni che consentano una significativa produzione di prole sono da evitare. Se si preferisce, la scala cronologica sperimentale può essere spostato indietro: abbiamo già avviato l'esposizione a una tossina ambientale presso il tardo L3 fase larvale (36 ore) e svolto bioluminescenza e GFP misurazioni a 55 ore 2 sfondi alternativa, genetiche che sono condizionalmente sterili. può essere usato per prevenire la produzione di progenie, ad esempio la fer-15 (b16) II; fem-1 (hc17) IV doppio mutante che può essere mantenuta a 15 ° C, ma è sterile a 25 ° C. 24 L'uso di FUDR per indurre la sterilità non è raccomandata in quanto può di per sé influenzare il metabolismo dei nematodi. 25 Il test potrebbe essere eseguita anche in ceppi con cuticole più permeabili, come parziale perdita di function bus-8 mutanti che sono multidrug-sensibili a causa di aumentare la permeabilità dei farmaci. 26 Ciò faciliterà le esposizioni più brevi e le concentrazioni di composti minori. Le condizioni per l'aggiunta di luciferina di questi nematodi Potrebbe anche essere necessario regolare ovvero, 1% DMSO e 0,05% Triton-X100 nel buffer luminescenza non può essere richiesto di migliorare la disponibilità luciferina.
Il protocollo utilizza 1% DMSO come veicolo per la consegna composto. Anche se non letali, questa concentrazione di DMSO ha alcuni effetti biologici come abbiamo discusso in una precedente pubblicazione. 3 Molte delle librerie farmaco disponibile è redatto in 100% DMSO, a concentrazioni che saranno adatti per dosaggi cellulari dopo la diluizione del veicolo al 0,1%. Le concentrazioni più elevate composti sono tenuti a ottenere risposte in C. elegans rispetto alle cellule umane, in modo tale che spesso non è possibile condurre saggi a inferiore all'1% DMSO. Ancora una volta, l'uso di ceppi conpiù cuticole permeabili possono portare a test con concentrazioni più basse di veicolo. Le concentrazioni di DMSO superiore all'1% non sono raccomandati.
Un tempo impostato incubazione con luciferina prima lettura dovrebbe essere rispettata. Come precedentemente illustrato, luminescenza raggiunge i suoi livelli massimi nel secondo minuto dopo l'aggiunta luciferina, rimanendo relativamente stabile per i primi 5 minuti, seguito da una lenta diminuzione graduale luminescenza nel prossimo 30 min 1. Risposte cinetica per una particolare sostanza chimica può essere effettuata durante la fase iniziale di 30 minuti dopo l'erogazione iniziale di luciferina.
Il protocollo prevede una fase di inedia dopo la raccolta delle uova per ottenere la sincronizzazione della popolazione di nematodi. Si consiglia la sincronizzazione delle popolazioni di prova nematode da diversi stadi di sviluppo si differenziano per livelli di ATP cellulare e possono rispondere in modo diverso ai composti di prova. Effettuando la fame in S completomedio rispetto a M9, i nematodi cova sono dotati di una fonte di carbonio (etanolo), in modo che le larve non sviluppano ma non sono completamente affamate. 27,28 È stato anche dimostrato che arrestato L1 del sono innescato di risposta rapida e cibo normale crescita L1 viene raggiunta entro 3 ore dopo il cibo diventa disponibile. 29 Tuttavia, la possibilità che la fase inedia può alterare il metabolismo di C. elegans non può essere escluso. 30 Per questo motivo la lunghezza di fame non deve superare 24 ore (18 ore è sufficiente per la sincronizzazione). Alcuni laboratori possono avere la possibilità di utilizzare una Copas Biosorter per la sincronizzazione età scavalcando il passo inedia del tutto. Altri laboratori possono avere una preferenza per l'espansione della popolazione di nematodi su terreni solidi (piastre NGM con OP50) prima di sbiancamento (passo 3.1) e questo funziona bene anche. Usiamo S medio durante l'esposizione composto come mezzo standard per nematode coltura, however altri mezzi possono essere selezionati, per esempio K medio o EPA moderatamente acqua dura vengono spesso utilizzati per gli studi ecotossicologici. 31,32
Il protocollo fornisce un mezzo per lo screening e per individuare i candidati per ulteriori test in termini di effetti sulla funzione mitocondriale. Nella fase di screening primario, è probabile che alcuni composti saranno state perse a causa di una sola concentrazione in fase di test, pertanto schermi di droga non devono essere considerate esaustive. Hits possono essere convalidati con l'uso di tecniche di valutazione diversi aspetti della funzione mitocondriale per il consumo ad esempio ossigeno, C. elegans Ceppi con GFP esprimere mitocondri, macchie di potenziale di membrana mitocondriale e / o misurazioni ROS. 16,33,34 La maggior rilievo della metodologia è di avere un mezzo per lo screening gran numero di composti e / o le condizioni a livello organismal multicellulare, e soprattutto per poter usufruire di the trattabilità genetica di C. elegans per indagare meccanismi di azione. La tecnica può aiutare ad accelerare e trovare nuovi percorsi alla scoperta di composti e obiettivi interessanti. Si prevede che la combinazione del sensore con sfondi genetiche associate con la malattia umana per lo screening di librerie di composti in un contesto rilevante malattia avrà molto da offrire.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.
Materials
| Orion II Microplate Luminometer | Berthold Detection Systems | with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| FLx800 fluorimeter | Biotek | with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| Ks 130 basic shaking platform | Ika | #0002980000 | |
| Innova 4349 | New Brunswick Scientific | Refrigerated incubator shaker | |
| Eppendorf centrifuge 5804R | Eppendorf | with eppendorf rotor A-4-44 (for 50/15ml tubes) | |
| Stripette, Costar | Corning | #4489 | Serological pipette |
| Cellstar 50 ml tubes | Greiner bio-one | #227661 | |
| Cellstar 15 ml tubes | Greiner bio-one | #188261 | |
| Cellstar 60 mm tissue culture plates | Greiner bio-one | #628160 | |
| Superfrost Microscope slides | VWR | #631-0909 | |
| Sterile spatula | Corning | #3007; #3004 | for weighing out chemicals |
| 0.22 mM Millex GP filters | Millipore | #SLGP033RS | |
| Axygen eppendorf tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | #MCT-150-R | |
| Corning 96 well assay plate | VWR | #3603 | Black plate clear bottom with lid |
| Nunc 96 well assay plate | Fisher Scientific | #236105 | White plate with lid |
| Reservoir reagent 60 mL | Thermo Scientific Finnpipette | #9510027 | used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1) |
| Storage box/damp chamber | Roche Diagnostics | #10 800 058 001 | 174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid |
| Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content | Sigma Aldrich | #239305 | Store in aliquots at 4°C, seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil |
| D-Luciferin, potassium salt | Biotium Inc | # 10101-2 | Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | # P9416 | |
| DMSO | CalBiochem | #317275 | Purity 99.99% |
| Triton X100 | Alfa Aesar | #A16046 | Diltute to 10% in ddH20 |
| Nystatin | CalBiochem | #475914 | |
| C. elegans bioluminescent strains | Author's own laboratory | PE254, PE255 | contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then. |
| E. coli OP50 | CGC | ||
| General chemicals | Sigma Aldrich/Fisher Scientific |
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