Screenable<em> In vivo</em> Assay עבור מיטוכונדריאלי מאפנני שימוש הטרנסגניים Bioluminescent<em> Elegans Caenorhabditis</em
Summary
A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.
Abstract
The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode’s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.
Introduction
המטרה הכוללת של הליך זה היא הכימות המהיר של מצב האנרגיה של ג elegans in vivo עם נוף לשימוש זה כנקודת סיום בהקרנת מתחם. הרציונל מבוסס על הביטוי המהונדס של לוציפראז הגחלילית בג נמטודות elegans 1-3 באמצעות פלסמיד (1 pSLGCV https://www.addgene.org/49862). האנזים בלוציפראז הוא התמזגו לGFP חלבון פלואורסצנטי הירוק ובא לידי ביטוי בכל מקום וconstitutively בציטופלסמה (peroxisome לוציפראז מיקוד אות הוסר). זה מוביל לפליטת אור כאשר luciferin המצע מסופק אקסוגני. כתולעת היא שקופה, אור ניתן למדוד בluminometer כיחידות יחסי אור (RLU). דלקי ATP סלולריים תגובת פליטת אור וזמינותו קובעים את רמות האור מיוצרות. כתוצאה מכך, luminometry מציע convenienלא אומר להערכת רמות ה- ATP היחסית ועל ידי פונקציה של המיטוכונדריה הרחבה, מאז ייצור ATP מתרחש בעיקר במיטוכונדריה. קשר בין רמות תפקוד ופליטת האור של המיטוכונדריה כבר הוכיח בעבר באמצעות ההשתקה של גני המיטוכונדריה הובלת אלקטרונים שרשרת ונלווית תפוקת אור מופחתת. 1
זני פליטת אור שנוצרו היו מיועדים PE254 (feIs4) ו PE255 (feIs5) 1 (ראה רשימת חומרים) וניתן להשתמש בם לסירוגין. 3 מספר המחקרים מנוצל זני חיישן אלה לדווח על רמות ה- ATP הסלולריות in vivo לאחר חשיפה לכימיקלים xenobiotic שונים כגון אזיד הנתרן 1, 2 קדמיום, ביוב בוצת תמצית 3, 5'-fluoro-2-deoxyuridine 6, וnitrosamine טבק ספציפי 7. גם הזנים היו שימושיים כדי לפקח על השפעות של חשיפה לקרינת אולטרה סגולה C <sעד> 8 ואת ההשפעות של שיבוש תפקוד שרשרת הנשימה במיטוכונדריה. 1.9 גרסה מוקדמת של חיישן הארה המבטא את הגן בלוציפראז ללא היתוך GFP (PE39) שימשו גם בחקירת השפעות של מתכות כבדות ושל דרכי הנשימה . Uncoupler 10 זני PE254 וPE255 לשאת לוציפראז: הקרינה היתוך וGFP GFP הוצגה להגדיל באופן יחסי עם מסת נמטודות, מציע אמצעי נוח לנורמליזציה של ערכי הארה 6,9 ההשפעות של סכום ההפרש של תולעים בכל טוב יכולות להיות גם. נלקח בחשבון על ידי כולל משכפל טכני מרובה בassay (מינימום של 5 בארות לכל מצב). 3
הפרוטוקול מציע את האפשרות של ניטור vivo של רמות אנרגיה (בניגוד ליותר מבחינה טכנית מייגע במבחנה קביעות ATP) מאפשר הקרנת מתחם ולמקם מחדש בהקשר הפיזיולוגי של כל muהאורגניזם lticellular. ההליך יכול להתארך למגוון של רקע גנטי על ידי חציית transgene המשולב chromosomally לזנים מוטנטים זמינים ו / או על ידי השתקת גנים על ידי התערבות RNA; כך, תוך ניצול מלא של ג elegans כאורגניזם מודל. השיטה אמורה לעזור להפחית כישלון בשלב מאוחר של מועמדי סמים בשל רעילות המיטוכונדריה ולתרום תרומה לצמצום ניסויים בבעלי חיים גבוהים יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
אורגניזם המודל C. elegans מספק מערכת ניסיונית חזקה. זה קל לתרבות ומייצר צאצאים זהים גנטי בשפע עם מחזור חיים 3.5 יום מביצה ללהתרבות מבוגר (דרך שלבי זחל לנוער L1 עד L4). בשל גודלו הקטן, זה יכול להיות מבוגר בנוחות ב96-גם צלחות, להקל הקרנת מתחם. אנו מציגים פרוטוקול הקרנה פנוטיפי המבוסס על זנים של ג elegans הפועלים כin vivo חיישנים של רמות אנרגיה. 14 הפרוטוקול ישים לכל מעבדה, אם כי נדרש luminometer צלחת 96-היטב וקבינט סטרילי. זה חשוב כדי למנוע זיהום במבחנים על ידי שימוש בטכניקת מעבדה טובה. אם עובד באופן ידני, את המספר המרבי של צלחות נמטודות השגה הוא 13 לכל ניסוי המאפשר בדיקה של 2x צלחות תרופת 96-היטב וכולל שתי צלחות רכב. נציגי תוצאות מוצגות למורכבת המיטוכונדריה אני מעכב rotenonדואר, גנרטור paraquat סופראוקסיד, oxaloacetate ביניים מחזור חומצת לימון וארבע תרכובות עם פעילות מעכבת גחלילית בלוציפראז ידועה. שתי התרכובות הראשונות הובילו לירידה בפליטת אור כפי שחזו ואילו oxaloacetate הוביל לשיפור, עשוי לנבוע מדור גדול יותר של ה- ATP. ערכות נתונים oxaloacetate גם להדגים את השונות המהותיות בניסויים מבוססים על לוציפראז גחלילית ככתב. מינימום של שלושה ניסויים בלתי תלויים הם מומלץ לוודא חוסן של תגובות לתרכובות בלתי ידועות.
העיכוב של פעילות לוציפראז גחלילית היה מזוהה עם assay במבחנה באמצעות ערכה מסחרית. 3 אחד המתחמים הביאו לעלייה משמעותית בקרינת GFP בקנה אחד עם מעכב הגדלת הרמות של גחלילית בלוציפראז באמצעות קשירת האנזים של לוציפראז פעיל מתויג GFP אתר, והופך אותו ליותר יציב. 15 במקרים מסוימים(לא במקרה הספציפי הזה) זה יכול להוביל לרמות גבוהות של פליטת אור כאשר המעכב שנעקר על ידי מצע עודף. 15 הוא, לכן, חשוב שלא לפרש את התוצאות בטעות מתרכובות שאינטראקציה עם אנזים הגחלילית כירידה או עליית רמות ה- ATP / פונקציה של המיטוכונדריה. שינויים באות הארה לעתים קרובות למדי לתאם עם מדידות נוספות של בריאות כגון תנועה, התפתחות וצמיחה. כדוגמא, מתחם הוא מעכב לוציפראז חשוד אם ירידה דרמטית באות פליטת אור מזוהה אך תולעים הם נבדלים מבקרות על ידי תצפית מיקרוסקופית. עלייה בקרינת GFP, לא מוסברת על ידי גידול או autofluorescence מתחם, יכולה גם להצביע על מעכב. מספר מעכבי לוציפראז 15 ידוע וכבר נכנס לPubChem. לכן במקרה הראשון, זה תרגול טוב להתייעץ מידע על מעכבי לוציפראז מוחזקים על ידי PubChem; אחרי testing של השפעות המתחם במבחני חוץ גופייה עם האנזים המטוהר 3 ו / או אישור של השפעות על תפקוד המיטוכונדריה ידי אמצעים נוספים. 16,17
מדידות הקרינה GFP מאפשרות זיהוי של רמות לוציפראז גחלילית (וזיהוי הפוטנציאל של כמה מעכבי אנזים בלוציפראז כפי שפורט לעיל) מה שהופך את מקרה חזק למדידת נקודת קצה זו לצד פליטת אור במידת האפשר. נורמליזציה של קריאות פליטת אור לGFP היא גם אמצעי לטיפול חשבונאי בשינויים במספרי תולעת בין בארות (אם כי זה יכול גם להיות מושגת על ידי הכללה של משכפל טכני מרובה). לרגישות רבה יותר, חשוב להפחית הקרינה רקע מקריאות. הפרוטוקול מעריך את התרומה של ההשעיה החיידקים לקרינת הרקע, לעומת זאת autofluorescence נמטודות לא היווה (הגבלה של assay הנוכחי, קריטית במיוחד לכל סטו הזדקנותבהתחשב בכך שמת עליות autofluorescence נמטודות עם גיל). גם autofluorescence של תרכובות מבחן צריך להיות מוערך במקביל. הנורמליזציה GFP הייתה נראית הכרחית שבו חוקרים מבקשים להתאים את הפרוטוקול כדי להשוות בריכות ATP סלולריות במוטציות גנטיות שונות או אחרי ההשתקה של גנים שונים, במטרה לשלוט על כל הבדלי מתח ברמת הביטוי של transgene פליטת אור.
פרמטרים קריטיים בפרוטוקול כוללים את השלב ההתפתחותי שבו חשיפה היא יזם, אורך החשיפה, וקבלת מספרים דומים של נמטודות בבארות שונות. חשיפה יכולה להתחיל בכל שלב של התפתחות של נמטודות, אולם שלב L3 ומעלה עדיפה. משלב זה והלאה, נמטודות תלויה בזרחון חמצוני לפיתוח לבגרות, כפי שמעיד גידול מאוד משמעותי בתוכן mtDNA, צריכת חמצן ורמות ה- ATP. 18,19,20 הפרוטוקול הנוכחי יוזם ירידייור בשלב L4. הסיבה לaliquoting נמטודות ל96-גם צלחות רק בשלב זה (ולא כאשר הם סיפקו ראשון עם מזון בשלב L1), היא שלמרות צלחות מונחות בתאים לחים כדי למזער אידוי, מידת האידוי עדיין מתרחשת ב החממה שלנו רועד, נראית כטיפין קטנות מאוד להרכיב על העפעפיים (זה לא יכול להיות בעיה עם חממות רועדות אחרות). על ידי aliquoting נמטודות לצלחות ממש לפני התוספת של תקני סמים, ריכוז התרופה בפועל אינו מושפע מכל וריאציה קטנה בנפח בשל התאדות. טעינת צלחת נמטודות עם רכב היחיד היא שימושית כדי לבדוק שנמטודות חולקו באופן שווה בין בארות. כל הבדלים מובהקים לרכב רק צלחת יהיו מעידים על טכניקה לקויה מחלק נמטודות לבארות.
אורך החשיפה הוא גורם חשוב לשקול. אם השפעות על מצב אנרגיה באופן עצמאי של צמיחה של עניין, פרוtocol יכול להיות שונה כדי להתאים חשיפות קצרות יותר (מתגובות כמעט מיידיות ל, למשל, 2 שעות). מצד השני, כניסה של תרכובות לג רקמות elegans עשויות לקחת קצת זמן. לדוגמא נדרשות 12-24 שעות כדי להשיג ריכוזים פנימיים מרביים של רזברטרול ו5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR). 21 לכן, חשיפה ארוכה יותר (18 עד 24 שעות) עשויות להיות מוצדקות על מנת למקסם את רמות חשיפה. זמן החשיפה צריך להיות מוגבל לפעמים שאינם מאפשרים רמות משמעותיות של רבייה להתקיים בבאר. אנו ממליצים שהזמן התפתחותי הכולל של נמטודות נשמר תחת 66-67 שעות. למרות נוח, נמטודות הם מעוברת עד אז ויזמה egglaying. עם זאת מצאנו קריאות פליטת אור מהכנות ביצה להיות זניח (לא מוצג). ביטוי transgene מונע sur-5 האמרגן מזוהה ראשון רק 01:58 שעות וחצי לאחר הפריה בשלב 100 התא 22 וגקליפת הביצה hitinous עשויה להגביל כניסה של luciferin. אחרים מצאו כי ביצי embryonated לא תרמו באופן משמעותי לחילוף החומרים של מבוגרים הרה להולדת. 23 עם זאת, תנאים המאפשרים ייצור צאצאים משמעותי יש להימנע. אם העדיף, לוח הזמנים הניסיוניים יכול להיות מוזזים לאחור: יש לנו יזמנו בעבר חשיפה לרעלן סביבתי בשלב (36 שעות) הזחל מאוחר L3 וביצעו מדידות פליטת אור וGFP ב 55 שעות 2 רקעים לחלופין, גנטיים שתנאים סטריליים. יכול לשמש כדי למנוע ייצור צאצאים, כמו למשל FER-15 (B16) השני; FEM-1 מוטציה כפולה IV (hc17) אשר יכול להישמר על 15 מעלות צלזיוס, אך הוא סטרילי בC ° 25. 24 השימוש בFUDR לגרום לעקרות אינו מומלץ כמו זה יכול בעצמו משפיע על חילוף חומרים נמטודות. 25 assay יכול גם להתבצע בזנים עם העור הקרני חדיר יותר כגון פסד של funct החלקייון אוטובוס-8 מוטציות שהם multidrug רגיש בשל להגדיל חדירות של תרופות. 26 זה יקלו חשיפות וריכוזים נמוכים מתחם קצרים יותר. התנאים להוספת luciferin לנמטודות אלה עשויים גם צריכים התאמה כלומר, 1% DMSO ו0.05% Triton-X100 במאגר הארה לא ייתכן שיידרשו כדי לשפר את זמינות luciferin.
הפרוטוקול משתמש 1% DMSO כרכב למסירת מתחם. למרות שאינו קטלני, ריכוז זה של DMSO יש כמה תופעות ביולוגיות כפי שכבר דנו בפרסום קודם. 3 רבים של ספריות תרופה הזמינות ערוכים 100% DMSO, בריכוזים שיהיו מתאימים למבחנים מבוססי תאים לאחר הדילול של רכב 0.1%. ריכוזים גבוהים יותר מתחם נדרשים לעורר תגובות בג elegans בהשוואה לתאים אנושיים, כך שלעתים קרובות לא ניתן לערוך מבחני בנמוכים מ 1% DMSO. שוב, השימוש בזנים עםיותר העור הקרני חדיר עלול להוביל לבדיקה עם ריכוזים נמוכים של רכב. ריכוזים של% גבוהים יותר מאשר 1 DMSO אינם מומלצים.
זמן דגירה סט עם luciferin לקראת קריאה צריך להיות דבק. כפי שניתן לראות בעבר, הארה מגיעה לרמות המרביות שלה בתוך דקות השניה לאחר הוספת luciferin, שנותר יציב יחסית ל5 דקות הראשונות, ואחריו ירידה הדרגתית איטית בהארה על 30 דקות הבאות 1. יכולים להתבצע תגובות הקינטית לכימי מסוים בשלב ראשוני זה של 30 דקות אחרי מחלק ראשוני של luciferin.
הפרוטוקול כרוך צעד רעב הבא אוסף של ביצים כדי להשיג סנכרון של אוכלוסיית נמטודות. אנו ממליצים סנכרון של אוכלוסיות מבחן נמטודות מאז שלבי התפתחות שונים נבדלים ברמות ה- ATP סלולריות ועשויים להגיב באופן שונה לתרכובות הבדיקה. על ידי ביצוע הרעב במלא Sבינוני בניגוד לM9, נמטודות הבקיעה מסופקות עם מקור פחמן (אתנול), כך זחלים שלא לפתח אך לא מורעבות לחלוטין. 27,28 זה גם הוכח שנעצר L1 של דרוכים לתגובה מהירה למזון ו שיעור L1 נורמלי צמיחה מושגת בתוך 3 שעות לאחר אוכל הופך להיות זמין. 29 עם זאת, האפשרות שצעד הרעב עשוי לשנות את חילוף החומרים של ג לא ניתן לשלול elegans. 30 מסיבה זו באורך של רעב לא יעלה על 24 שעות (18 שעות מספיקות לסנכרון). ייתכן שיש לי מעבדות מסוימות את האפשרות של שימוש Biosorter קופאס לסנכרון גיל עוקף את צעד הרעב לגמרי. ייתכן שיש לי מעבדות אחרות העדפה להרחבת אוכלוסיית נמטודות על תקשורת מוצקה (צלחות NGM עם OP50) לפני ההלבנה (שלב 3.1) וזה יעבוד היטב גם. אנו משתמשים במדיום S במהלך חשיפת מתחם כמדיום סטנדרטי עבור culturing נמטודות, however תקשורת אחרת ניתן לבחור, למשל בינוני K או די מים קשים EPA משמש לעתים קרובות ללימודי ecotoxicological. 31,32
הפרוטוקול מספק אמצעי לסינון ולזהות מועמדים לבדיקות נוספות במונחים של ההשפעות על תפקוד המיטוכונדריה. בשלב הסינון ראשוני סביר להניח כי כמה תרכובות יהיו כבר החמיצו בשל נבדק רק אחד ריכוז, לכן מסכי תרופה לא צריכים להיחשב ממצה. יכולים להיות מאומתים על ידי להיטי השימוש בטכניקות להערכת היבטים שונים של תפקוד המיטוכונדריה לצריכת חמצן דוגמא, ג elegans זנים עם מיטוכונדריה GFP להביע, כתמים לפוטנציאל קרום המיטוכונדריה ו / או מדידות ROS. 16,33,34 המשמעות הגדולה ביותר של המתודולוגיה היא להיות אמצעי לסינון מספר רב של תרכובות ו / או תנאים ברמת האורגניזם רב-תאית, וחשוב מכך כדי להיות מסוגל לנצל את הנְהִילוּת הגנטית דואר של ג elegans לחקור מנגנוני פעולה. הטכניקה עשויה לעזור להאיץ ולמצוא נתיבים חדשים לגילוי של תרכובות ויעדים מעניינים. זה שחזה כי השילוב של החיישן עם רקע גנטי הקשורים למחלות בבני אדם להקרנה של ספריות מתחם בהקשר רלוונטי מחלה יש הרבה מה להציע.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.
Materials
| Orion II Microplate Luminometer | Berthold Detection Systems | with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| FLx800 fluorimeter | Biotek | with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| Ks 130 basic shaking platform | Ika | #0002980000 | |
| Innova 4349 | New Brunswick Scientific | Refrigerated incubator shaker | |
| Eppendorf centrifuge 5804R | Eppendorf | with eppendorf rotor A-4-44 (for 50/15ml tubes) | |
| Stripette, Costar | Corning | #4489 | Serological pipette |
| Cellstar 50 ml tubes | Greiner bio-one | #227661 | |
| Cellstar 15 ml tubes | Greiner bio-one | #188261 | |
| Cellstar 60 mm tissue culture plates | Greiner bio-one | #628160 | |
| Superfrost Microscope slides | VWR | #631-0909 | |
| Sterile spatula | Corning | #3007; #3004 | for weighing out chemicals |
| 0.22 mM Millex GP filters | Millipore | #SLGP033RS | |
| Axygen eppendorf tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | #MCT-150-R | |
| Corning 96 well assay plate | VWR | #3603 | Black plate clear bottom with lid |
| Nunc 96 well assay plate | Fisher Scientific | #236105 | White plate with lid |
| Reservoir reagent 60 mL | Thermo Scientific Finnpipette | #9510027 | used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1) |
| Storage box/damp chamber | Roche Diagnostics | #10 800 058 001 | 174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid |
| Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content | Sigma Aldrich | #239305 | Store in aliquots at 4°C, seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil |
| D-Luciferin, potassium salt | Biotium Inc | # 10101-2 | Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | # P9416 | |
| DMSO | CalBiochem | #317275 | Purity 99.99% |
| Triton X100 | Alfa Aesar | #A16046 | Diltute to 10% in ddH20 |
| Nystatin | CalBiochem | #475914 | |
| C. elegans bioluminescent strains | Author's own laboratory | PE254, PE255 | contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then. |
| E. coli OP50 | CGC | ||
| General chemicals | Sigma Aldrich/Fisher Scientific |
References
- Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans. BMC Physiol. 8, 7 (2008).
- Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor. Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).
- McLaggan, D., et al. Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor. PloS one. 7, e46503 (2012).
- Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells. Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).
- Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5′-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
- Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans. Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).
- Leung, M. C., et al. Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).
- Kuang, J. J., Ebert, P. R. The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism. Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).
- Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors. FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Brenk, R., et al. Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases. ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).
- Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. . Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).
- Thorne, N., et al. Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter. Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).
- Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497, 451-457 (2013).
- Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Pharmacological approaches to restore mitochondrial function. Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).
- Tsang, W. Y., Lemire, B. D. Mitochondrial genome content is regulated during nematode development. Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).
- Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans. Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).
- Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
- Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods. PloS one. 8, e56877 (2013).
- Yochem, J., Gu, T., Han, M. A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis. Genetics. 149, 1323-1334 (1998).
- Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans. J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, 1101-1112 (2002).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev Biol. 317, 549-559 (2008).
- Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae. PloS one. 7, (2012).
- Baugh, L. R. To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest. Genetics. 194, 539-555 (2013).
- Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest. Science. 324, 92-94 (2009).
- Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans. Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).
- Cressman, C. P., Williams, P. L. Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media. Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).
- Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media. Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).
- Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response. Genetics. 174, 229-239 (2006).
- Yang, W., Hekimi, S. A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans. Plos Biol. 8, (2010).
