A للمسح<em> في فيفو</em> الفحص للالميتوكوندريا المغيرون في الموجة الكهرومغناطيسية عن طريق المعدلة وراثيا للإضاءة الحيوية<em> انواع معينة ايليجانس</em
Summary
A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.
Abstract
The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode’s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.
Introduction
الهدف العام من هذا الإجراء هو تقدير سريع للوضع الطاقة في C. ايليجانس في الجسم الحي بهدف استخدام هذا بمثابة نقطة النهاية في فحص المركبة. ويستند هذا المنطق على التعبير المعدلة وراثيا من يراعة luciferase في C. الخيطية ايليجانس 1-3 عن طريق البلازميد pSLGCV (1 https://www.addgene.org/49862). وتنصهر انزيم luciferase المراسل إلى بروتين الفلورية الخضراء GFP وأعرب جوهري وبتواجد مطلق في السيتوبلازم (تم إزالة بيروكسية luciferase المراسل استهداف إشارة). وهذا يؤدي إلى انبعاث الضوء عندما يتم توفير الركيزة luciferin خارجيا. كما الدودة شفافة، وعلى ضوء يمكن قياسها في luminometer وحدات الخفيفة النسبية (RLU). الوقود ATP الخلوية رد فعل تلألؤ بيولوجي وتوافره يحدد مستويات الخفيفة المنتجة. ونتيجة لذلك، luminometry يقدم مريحهر يعني تقييم مستويات ATP النسبية وبالتالي وظيفة الميتوكوندريا، لأن إنتاج ATP يحدث بشكل رئيسي في الميتوكوندريا. وقد ثبت وجود صلة بين مستويات ظيفة وتلألؤ بيولوجي الميتوكوندريا سابقا من خلال إسكات الجينات الميتوكوندريا سلسلة نقل الإلكترون ويصاحب ذلك انخفاض ناتج الضوء. 1
سلالات تلألؤ بيولوجي ولدت وعينت PE254 (feIs4) و PE255 (feIs5) 1 (انظر قائمة المواد)، ويمكن أن تستخدم بالتبادل. 3 وقد استخدمت عدد من الدراسات هذه السلالات استشعار للإبلاغ عن مستويات ATP الخلوية في الجسم الحي بعد التعرض لمواد كيميائية مختلفة أجنبي بيولوجيا مثل أزيد الصوديوم 1، الكادميوم 2 والصرف الصحي استخراج الحمأة 3، 5'-الفلورية 2-deoxyuridine 6، ونيتروسامين التبغ محددة 7. وكانت سلالات من المفيد أيضا رصد تأثيرات التعرض للأشعة فوق البنفسجية C <sتصل> 8 وآثار تعطيل سلسلة الميتوكوندريا وظيفة الجهاز التنفسي. 1،9 كما تم استخدام نسخة مبكرة من أجهزة الاستشعار التلألؤ التعبير عن الجينات luciferase المراسل دون الانصهار GFP (PE39) في التحقيق في آثار المعادن الثقيلة وعلى الجهاز التنفسي . uncoupler 10 سلالات PE254 PE255 وتحمل luciferase المراسل: تبين GFP الانصهار وGFP مضان لزيادة متناسبة مع النيماتودا الإعلام، حيث تتيح وسيلة مريحة للتطبيع القيم التلألؤ 6،9 آثار مبلغ الفرق من الديدان لكل بئر ويمكن أيضا أن يكون. تؤخذ بعين الاعتبار من قبل بما في ذلك مكررات تقنية متعددة في مقايسة (ما لا يقل عن 5 آبار في حالة). 3
بروتوكول يتيح إمكانية الرصد في الجسم الحي من مستويات الطاقة (على العكس من أكثر شاقة من الناحية الفنية في المختبر قرارات ATP) مما يتيح فحص المركبة وتغيير وضعيتها في سياق الفسيولوجية لمو كلهكائن lticellular. ويمكن تمديد هذا الإجراء إلى مجموعة متنوعة من خلفيات وراثية عن طريق عبور التحوير متكاملة صبغويا إلى سلالات متحولة المتاحة و / أو إسكات الجينات التي تدخل الحمض النووي الريبي. وهكذا، مع الاستفادة الكاملة من C. ايليجانس بوصفه الكائن نموذج. يجب أن الأسلوب تساعد في الحد من فشل المرحلة في وقت متأخر من المرشحين المخدرات نظرا لسمية الميتوكوندريا وتقديم مساهمة نحو الحد من أعلى التجارب على الحيوانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكائن الحي نموذج C. يوفر ايليجانس نظام تجريبي قوي. فمن السهل أن تنتج ثقافة وفيرة ذرية متطابقة جينيا مع دورة حياة 3.5 يوم من البيض لاستنساخ الكبار (عبر مراحل اليرقات الأحداث L1 حتى L4). ونظرا لصغر حجمه، فإنه يمكن زراعتها بشكل ملائم في لوحات 96-جيدا، وتسهيل فحص المركبة. نقدم بروتوكول الفحص المظهري بناء على سلالات C. ايليجانس التي تقوم بدور في الجسم الحي أجهزة الاستشعار من مستويات الطاقة. 14 البروتوكول ينطبق على أي مختبر، على الرغم من أن هناك حاجة إلى luminometer لوحة 96-جيدا والحكومة العقيمة. من المهم لمنع التلوث في فحوصات باستخدام تقنية المختبرات الجيدة. إذا كان يعمل يدويا، والحد الأقصى لعدد لوحات الديدان الخيطية يمكن تحقيقه هو 13 في التجربة السماح للاختبار 2X لوحات المخدرات 96-جيدا وبينهم اثنان من لوحات المركبات. يتم عرض نتائج ممثل للمجمع الميتوكوندريا I المانع rotenonه، مولد الباراكوات الفائق، ودورة حمض الستريك أوكسالوآسيتات المتوسطة وأربع مركبات مع المعروف النشاط المثبطة يراعة luciferase. أدت المركبين الأولى إلى انخفاض في تلألؤ بيولوجي كما كان متوقعا في حين أوكسالوآسيتات أدى إلى تعزيز، من المرجح أن يؤدي من جيل أكبر من ATP. تظهر أيضا مجموعات البيانات أوكسالوآسيتات التغير الجوهري في تجاربه التي تستند إلى يراعة luciferase كمراسلة. ما لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة لا ينصح للتأكد من متانة الردود على مركبات غير معروفة.
وتثبيط النشاط يراعة luciferase التعرف مع فحص في المختبر باستخدام طقم التجارية. 3 واحدة من المركبات أدى إلى زيادة كبيرة في GFP مضان بما يتفق مع مثبط زيادة مستويات يراعة luciferase المراسل ملزمة لانزيم luciferase المراسل النشط الموسومة GFP الموقع، وجعله أكثر استقرارا. 15 وفي بعض الحالات(وليس في هذه الحالة بالذات) وهذا يمكن أن يؤدي إلى زيادة مستويات تلألؤ بيولوجي عند النازحين المانع من قبل الركيزة الزائدة. 15. ولذا، من المهم عدم تفسير النتائج خطأ من المركبات التي تتفاعل مع انزيم يراعة كما انخفضت أو زيادة مستويات ATP / وظيفة الميتوكوندريا. التغييرات في إشارة التلألؤ في كثير من الأحيان ترتبط مع قياسات إضافية للصحة مثل الحركة والتطور والنمو. وكمثال على ذلك، وهو مركب هو luciferase المراسل المانع المشتبه به إذا تم الكشف عن الانخفاض الكبير في إشارة تلألؤ بيولوجي لكن الديدان لا يمكن تمييزها من الضوابط من خلال الملاحظة المجهرية. زيادة في GFP مضان، لا يفسر النمو أو مركب تألق ذاتي، قد يشير أيضا إلى المانع. ومن المعروف أن عددا من مثبطات luciferase المراسل 15، وقد دخلت حيز PubChem. لذلك، في المقام الأول، بل هو ممارسة جيدة للتشاور معلومات عن مثبطات luciferase المراسل تحتجزهم PubChem. تليها رesting من آثار مركب في فحوصات في المختبر مع انزيم المنقى 3 و / أو تأكيد من آثار على وظيفة الميتوكوندريا من قبل وسائل إضافية. 16،17
قياسات GFP مضان تمكين الكشف عن مستويات يراعة luciferase (والكشف المحتمل لبعض مثبطات انزيم luciferase المراسل كما نوقش أعلاه) مما يجعل حجة قوية لقياس هذه النهاية جنبا إلى جنب مع تلألؤ بيولوجي حيثما كان ذلك ممكنا. تطبيع قراءات تلألؤ بيولوجي لGFP هو أيضا وسيلة لتوضيح أسباب الاختلاف في الأرقام دودة بين الآبار (على الرغم من أن هذا يمكن أيضا أن يتحقق عن طريق إدراج مكررات التقنية متعددة). لمزيد من حساسية، من المهم طرح مضان الخلفية من القراءات. بروتوكول يقيم مساهمة تعليق البكتيرية إلى مضان الخلفية، ولكن لا تمثل الديدان الخيطية تألق ذاتي ل(وجود قيود على الفحص الحالي، حاسمة بشكل خاص لأي ستو الشيخوخةوفاة بالنظر إلى أن الزيادات الخيطية تألق ذاتي مع التقدم في السن). وينبغي أيضا تقييم تألق ذاتي من المركبات اختبار في نفس الوقت. سوف GFP تطبيع يبدو لا غنى عنه حيث يرغب الباحثون على التكيف بروتوكول لمقارنة حمامات ATP الخلوية في المسوخ وراثية مختلفة، أو بعد إسكات الجينات المختلفة، من أجل السيطرة على أي اختلافات الضغط على مستوى التعبير عن التحوير تلألؤ بيولوجي.
وتشمل المعايير الضرورية ضمن بروتوكول المرحلة التنموية التي يبدأ التعرض، ومدة التعرض، والحصول على أرقام مماثلة من الديدان الخيطية في آبار مختلفة. التعرض يمكن أن يبدأ في أي مرحلة من مراحل التنمية من الديدان الخيطية، ولكن مرحلة L3 أو أقدم الأفضل. من هذه المرحلة على والديدان الخيطية تعتمد على الفسفرة التأكسدية للتنمية في مرحلة البلوغ، كما يتضح من زيادة كبيرة جدا في المحتوى و mtDNA، واستهلاك الأوكسجين ومستويات ATP. 18،19،20 هذا البروتوكول يبدأ المعارضلدى عودتهم في المرحلة L4. سبب aliquoting الديدان الخيطية لوحات 96-جيدا فقط في هذه المرحلة (وليس عندما قدمت لأول مرة في المواد الغذائية في مرحلة L1)، هو أنه على الرغم من وضع لوحات في غرف رطبة لتقليل التبخر، وعلى درجة التبخر لا يزال يحدث في لدينا حاضنة الهز، وينظر إليها على أنها قطرات صغيرة جدا تتشكل على الجفن (وهذا قد لا يكون مشكلة مع حاضنات تهز أخرى). بواسطة aliquoting الديدان الخيطية لوحات قبل إضافة معايير المخدرات، لا يتأثر تركيز الدواء الفعلي من قبل أي اختلاف صغير في الحجم بسبب التبخر. تحميل لوحة الخيطية مع السيارة هو مفيد فقط للتأكد من أن الديدان الخيطية وزعت بالتساوي بين الآبار. فإن أي اختلافات كبيرة تم العثور عليها ل السيارة لوحة فقط يكون مؤشرا على تقنية الفقيرة في الاستغناء عن النيماتودا إلى الآبار.
طول التعرض هو عامل مهم للنظر فيها. إذا كانت الآثار على وضع الطاقة بشكل مستقل من النمو هي التي تهم، والمؤيديمكن تعديل tocol لاستيعاب التعرض أقصر (من استجابات فورية تقريبا، على سبيل المثال، 2 ساعة). من ناحية أخرى، دخول المركبات إلى C. الأنسجة ايليجانس قد يستغرق بعض الوقت. على سبيل المثال يطلب من 12-24 ساعة لتحقيق أقصى قدر من تركيزات الداخلية ريسفيراترول و 5 الفلورية 2'-deoxyuridine (FuDR). 21 لذلك، التعرض الطويل (18-24 ساعة) قد يكون له ما يبرره لتحقيق أقصى قدر من مستويات التعرض. الساعة التعرض ينبغي أن يقتصر على الأوقات التي لا تسمح مستويات كبيرة من الاستنساخ الذي سيعقد في البئر. ونحن نوصي بأن الوقت التنموي الكلي للالنيماتودا يتم الاحتفاظ تحت 66-67 ساعة. على الرغم من مريحة، وحامل الديدان الخيطية في ذلك الوقت، وقد بدأت egglaying. ومع ذلك وجدنا قراءات تلألؤ بيولوجي من الاستعدادات البيض لا تذكر (لا يظهر). يتم الكشف عن سور 5 المروج يحركها التعبير التحوير أول اثنين فقط لمدة سنتين وبعد نصف ساعة الإخصاب في مرحلة 100 خلية 22 وجومن المرجح أن تحد من دخول وسيفيرين قشر البيض hitinous. ووجد آخرون أن البيض المحتوي لم تساهم بشكل كبير في عملية التمثيل الغذائي للبالغين حامل. 23 ومع ذلك، والظروف التي تسمح بانتاج كبير ذرية هي التي ينبغي تجنبها. إذا كان يفضل، والجدول الزمني التجريبي يمكن أن تحول مرة أخرى: بادرنا قبل التعرض لسموم البيئية في أواخر L3 مرحلة اليرقات (36 ساعة) والتي أجريت القياسات تلألؤ بيولوجي وGFP في 55 ساعة 2 الخلفيات بدلا من ذلك، الوراثية التي هي عقيمة مشروط. يمكن استخدامها لمنع إنتاج ذرية، وعلى سبيل المثال فر-15 (B16) II. لا ينصح فيم-1 (hc17) IV متحولة المزدوج الذي لا يمكن الحفاظ عليه في 15 ° C، ولكن غير معقمة في 25 ° C. 24 استخدام FuDR للحث على العقم وهذا يمكن أن يؤثر في حد ذاته عملية التمثيل الغذائي الديدان الخيطية. 25 الفحص يمكن أن كما أن يؤديها في التوترات مع البشرة أكثر نفاذية مثل جزئية الخسارة من وfunctأيون حافلة 8 المسوخ التي هي نتيجة لزيادة نفاذية الأدوية الحساسة للأدوية المتعددة. 26 وهذا يسهل التعرض أقصر وتركيز مركب أقل. الشروط لإضافة وسيفيرين لهذه الديدان الخيطية يمكن أيضا تحتاج التعديل أي 1٪ DMSO و 0.05٪ تريتون-X100 في المخزن المؤقت التلألؤ قد لا تكون هناك حاجة لتعزيز توافر وسيفيرين.
يستخدم بروتوكول 1٪ DMSO كما سيلة لتسليم المجمع. وإن لم يكن قاتلا، وهذا تركيز DMSO لديه بعض التأثيرات البيولوجية كما ناقشنا في منشور السابق. 3 العديد من المكتبات المخدرات المتاحة مستعدون في 100٪ DMSO، بتركيزات من شأنها أن تكون مناسبة لفحوصات خلية القاعدة بعد التخفيف من السيارة إلى 0.1٪. ويلزم تركيز مركب أعلى للحصول على ردود في C. ايليجانس بالمقارنة مع الخلايا البشرية، بحيث غالبا ما يكون من غير الممكن إجراء فحوصات على أقل من 1٪ DMSO. مرة أخرى، واستخدام سلالات معقد يؤدي المزيد من البشرة منفذة لاختبار مع تركيزات أقل من المركبات. لا ينصح تركيزات DMSO أعلى من 1٪.
ينبغي التقيد الوقت المحدد الحضانة مع وسيفيرين قبل قراءات ل. كما هو موضح سابقا، التلألؤ يصل أقصى مستويات لها في الدقيقة الثانية بعد إضافة وسيفيرين، وتبقى مستقرة نسبيا لأول 5 دقائق، تليها انخفاض تدريجي بطيء في التألق على مدى 30 دقيقة المقبل 1. ويمكن إجراء استجابات حركية لمادة كيميائية معينة من خلال هذه المرحلة الأولية من 30 دقيقة بعد الاستغناء الأولي من وسيفيرين.
ويشمل البروتوكول خطوة جوعا بعد جمع البيض لتحقيق التزامن من السكان الديدان الخيطية. نوصي تزامن السكان اختبار النيماتودا منذ مراحل النمو المختلفة تختلف في مستويات ATP الخلوية وربما تستجيب بشكل مختلف للمركبات الاختبار. من خلال تنفيذ المجاعة في S كاملةمتوسطة بالمقارنة مع M9، يتم توفير الديدان الخيطية الفقس مع مصدر الكربون (الإيثانول)، بحيث اليرقات لا تتطور ولكنها لا تفتقر تماما. 27،28 كما تبين أن القبض على L1 وتستعد للاستجابة السريعة في الغذاء و ويتم تحقيق معدل نمو L1 العادي في غضون 3 ساعة بعد الغذاء تصبح متوفرة. 29 ومع ذلك، فإنه احتمال أن الخطوة المجاعة قد يغير التمثيل الغذائي للC. لا يمكن استبعاد ايليجانس. 30 لهذا السبب طول الجوع يجب أن لا تتجاوز 24 ساعة (18 ساعة كافية لمزامنة). قد يكون بعض المختبرات في إمكانية استخدام COPAS Biosorter لمزامنة عمر تجاوز الخطوة الجوع تماما. قد يكون غيرها من المختبرات تفضيل لتوسيع السكان الخيطية على وسائل الاعلام الصلبة (لوحات NGM مع OP50) قبل التبييض (الخطوة 3.1) وهذا سوف تعمل بشكل جيد جدا. نحن نستخدم S المتوسطة خلال التعرض مجمع كوسيلة القياسي لالنيماتودا زراعة، howeveص يمكن اختيار وسيلة أخرى، على سبيل المثال K متوسطة أو معتدلة EPA الماء العسر غالبا ما تستخدم للدراسات السمية البيئية. 31،32
وينص البروتوكول وسيلة لفحص وتحديد المرشحين لإجراء مزيد من التجارب من حيث الآثار المترتبة على وظيفة الميتوكوندريا. في مرحلة الفرز الأولية أنه من المحتمل أن يكون قد تم تفويت بعض المركبات بسبب تركيز واحد فقط يجري اختبارها، وبالتالي لا ينبغي النظر شاشات المخدرات شاملة. يضرب يمكن التحقق من صحة عن طريق استخدام تقنيات لتقييم جوانب مختلفة من وظيفة الميتوكوندريا للاستهلاك الأكسجين سبيل المثال، C. ايليجانس سلالات مع GFP معربا عن الميتوكوندريا، البقع على إمكانات غشاء الميتوكوندريا و / أو القياسات ROS. 16،33،34 أعظم أهمية المنهجية هو أن يكون وسيلة لفحص عدد كبير من المركبات و / أو شروط على المستوى العضوي متعددة الخلايا، والأهم من ذلك أن تكون قادرة على الاستفادة من الالبريد قابلية الإستطراق الجيني للC. ايليجانس للتحقيق في آليات العمل. تقنية قد تساعد على تسريع وإيجاد مسارات جديدة لاكتشاف مركبات والأهداف مثيرة للاهتمام. ومن المتصور أن الجمع بين أجهزة الاستشعار مع خلفيات وراثية مرتبطة الأمراض التي تصيب البشر لفرز مجموعات المركبات الكيميائية في سياق ذي صلة المرض سيكون لها الكثير لتقدمه.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.
Materials
| Orion II Microplate Luminometer | Berthold Detection Systems | with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| FLx800 fluorimeter | Biotek | with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| Ks 130 basic shaking platform | Ika | #0002980000 | |
| Innova 4349 | New Brunswick Scientific | Refrigerated incubator shaker | |
| Eppendorf centrifuge 5804R | Eppendorf | with eppendorf rotor A-4-44 (for 50/15ml tubes) | |
| Stripette, Costar | Corning | #4489 | Serological pipette |
| Cellstar 50 ml tubes | Greiner bio-one | #227661 | |
| Cellstar 15 ml tubes | Greiner bio-one | #188261 | |
| Cellstar 60 mm tissue culture plates | Greiner bio-one | #628160 | |
| Superfrost Microscope slides | VWR | #631-0909 | |
| Sterile spatula | Corning | #3007; #3004 | for weighing out chemicals |
| 0.22 mM Millex GP filters | Millipore | #SLGP033RS | |
| Axygen eppendorf tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | #MCT-150-R | |
| Corning 96 well assay plate | VWR | #3603 | Black plate clear bottom with lid |
| Nunc 96 well assay plate | Fisher Scientific | #236105 | White plate with lid |
| Reservoir reagent 60 mL | Thermo Scientific Finnpipette | #9510027 | used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1) |
| Storage box/damp chamber | Roche Diagnostics | #10 800 058 001 | 174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid |
| Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content | Sigma Aldrich | #239305 | Store in aliquots at 4°C, seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil |
| D-Luciferin, potassium salt | Biotium Inc | # 10101-2 | Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | # P9416 | |
| DMSO | CalBiochem | #317275 | Purity 99.99% |
| Triton X100 | Alfa Aesar | #A16046 | Diltute to 10% in ddH20 |
| Nystatin | CalBiochem | #475914 | |
| C. elegans bioluminescent strains | Author's own laboratory | PE254, PE255 | contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then. |
| E. coli OP50 | CGC | ||
| General chemicals | Sigma Aldrich/Fisher Scientific |
References
- Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans. BMC Physiol. 8, 7 (2008).
- Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor. Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).
- McLaggan, D., et al. Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor. PloS one. 7, e46503 (2012).
- Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells. Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).
- Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5′-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
- Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans. Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).
- Leung, M. C., et al. Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).
- Kuang, J. J., Ebert, P. R. The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism. Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).
- Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors. FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Brenk, R., et al. Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases. ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).
- Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. . Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).
- Thorne, N., et al. Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter. Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).
- Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497, 451-457 (2013).
- Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Pharmacological approaches to restore mitochondrial function. Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).
- Tsang, W. Y., Lemire, B. D. Mitochondrial genome content is regulated during nematode development. Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).
- Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans. Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).
- Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
- Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods. PloS one. 8, e56877 (2013).
- Yochem, J., Gu, T., Han, M. A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis. Genetics. 149, 1323-1334 (1998).
- Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans. J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, 1101-1112 (2002).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev Biol. 317, 549-559 (2008).
- Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae. PloS one. 7, (2012).
- Baugh, L. R. To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest. Genetics. 194, 539-555 (2013).
- Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest. Science. 324, 92-94 (2009).
- Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans. Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).
- Cressman, C. P., Williams, P. L. Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media. Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).
- Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media. Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).
- Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response. Genetics. 174, 229-239 (2006).
- Yang, W., Hekimi, S. A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans. Plos Biol. 8, (2010).
