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Biology

Arricchimento della matrice extracellulare proteine ​​da tessuti e digestione in Peptidi per l'analisi Spettrometria di Massa

Published: July 23, 2015
doi:
10.3791/53057
, ,
1Koch Institute for Integrative Cancer Research,Massachusetts Institute of Technology, 2Proteomics Platform,Broad Institute

Summary

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Abstract

La matrice extracellulare (ECM) è un complesso reticolo di proteine ​​cross-linked che offre spunti biofisici e biochimici che sono i principali regolatori della proliferazione cellulare, la sopravvivenza, la migrazione, ecc ECM svolge un ruolo importante nello sviluppo e nella diverse patologie tra cui cardio-vascolari e le malattie muscolo-scheletriche, la fibrosi e cancro. Così, che caratterizzano la composizione di ECM di tessuti normali e malati potrebbe portare alla identificazione di nuovi biomarcatori prognostici e diagnostici e potenziali bersagli terapeutici. Tuttavia, la natura stessa di proteine ​​ECM (grandi dimensioni, reticolati e un legame covalente, fortemente glicosilata) ha reso analisi biochimiche di ECM impegnativo. Per superare questa sfida, abbiamo sviluppato un metodo per arricchire ECMs dai tessuti e tumori freschi o congelati che sfrutta l'insolubilità di proteine ​​ECM. Descriviamo qui in dettaglio la procedura di decellularization che consiste di i sequenzialencubations a tamponi di diversa pH e concentrazioni di sale e di detersivi e che si traduce in 1) l'estrazione di intracellulare (citosolica, nucleare, membrana e citoscheletro) proteine ​​e 2) l'arricchimento di proteine ​​ECM. Abbiamo poi descritto come deglycosylate e digerire preparati proteici ECM arricchiti in peptidi per la successiva analisi mediante spettrometria di massa.

Introduction

La matrice extracellulare (ECM) è un complesso reticolo di proteine ​​reticolati e glicosilata che fornisce il supporto architetturale e di ancoraggio per le cellule e definisce, in parte, le proprietà biomeccaniche dei tessuti '1,2. Proteine ​​ECM segnalano anche alle cellule sia direttamente attraverso i loro recettori (ad esempio, integrine, syndecans, etc.) o modulando fattore di crescita segnalazione 3. L'ECM fornisce quindi spunti biofisici e biochimici che sono importanti regolatori del processi cellulari quali la proliferazione, la sopravvivenza, la polarizzazione, la differenziazione, la migrazione, etc.

L'ECM svolge un ruolo chiave nella fisiologia, lo sviluppo e l'invecchiamento 4. Inoltre, diverse patologie, come le malattie cardiovascolari, la fibrosi, malattie muscolo-scheletrici, i tumori, sono causati da, o provocano alterazioni ECM. Inoltre, l'ECM contribuisce al mantenimento di nicchie staminali e identificare molecole ECM chiave tha sostegno staminalità avranno applicazione diretta in ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa 5. Tuttavia, nonostante la sua importanza, la ECM è rimasta, fino a tempi recenti, underexplored 6.

In silico analisi ha rivelato che la matrisome, definito come l'insieme di ECM e proteine ​​ECM-associata, comprende i prodotti di diverse centinaia di geni sia nel umane e murine genomi 1,7,8. Tuttavia, l'insolubilità di proteine ​​ECM ha ostacolato la caratterizzazione sistematica della composizione di matrici extracellulari in vivo di campioni normali e patologici. Abbiamo dimostrato recentemente che questo insolubilità potrebbe essere girato a vantaggio e possono essere usate per arricchire proteine ​​ECM 8-10. Noi ed altri inoltre dimostrato che la spettrometria di massa era un metodo di scelta per caratterizzare la composizione della ECM 8 – 10, 13.

Noidescrivere qui un procedimento decellularization che consiste di incubazione sequenziali in tamponi di pH diversi e concentrazioni saline e detergente. Questa procedura comporta l'estrazione (o esaurimento) di proteine ​​citosoliche, nucleari, di membrana e del citoscheletro e l'arricchimento di proteine ​​ECM. Abbiamo poi descritto come digerire preparati proteici ECM arricchiti in peptidi per la successiva analisi mediante spettrometria di massa.

Utilizzando le procedure dettagliate ed illustrato, abbiamo arricchito con successo e caratterizzato da spettrometria di massa le matrici extracellulari provenienti da dieci diversi tessuti e tipi di tumore: normale polmone murino 8, umano e del colon murino 8,9, fegato umano 9, tumori colorettali umani e derivati metastasi epatiche 9, xenotrapianti melanoma 8, xenotrapianti tumorali mammarie 10, isolotti pancreatici murine e insulinomi murini (Naba et al., non pubblicati). Confronto tra le diverse matrisomes rivelato firme ECM tessutale e tumore-specifici che potrebbero ulteriormente essere usati come potenziali biomarker diagnostici o prognostici.

Crediamo che questo procedimento può essere applicato ad altri campioni senza o relativamente lievi modifiche.

Protocol

NOTA: La procedura può essere condotto su tessuti freschi o congelati in flash. Si consiglia di perfusione tessuti altamente vascolarizzati con PBS al momento della dissezione per eliminare globuli rossi e proteine ​​plasmatiche. Si sconsiglia della procedura sui tessuti fissi fissazione (cioè reticolazione chimica) interferisce con decellularization e può anche compromettere significativamente la successiva analisi di spettrometria di massa. Per l'intera procedura, si consiglia l'uso di tubi a bassa ritenzione e punte per pipette per massimizzare proteine ​​e peptidi recupero. 1. Decellularization di tessuti o di tumori NOTA: Prima di iniziare, preparare i reagenti e aggiungere inibitori della proteasi (fornito con il kit di estrazione Protein Vano) per il volume desiderato di ogni buffer. Tutti i tamponi e campioni devono essere tenuti in ghiaccio per la durata dell'esperimento tranne il tampone CS che deve essere mantenuto a temperatura ambiente per evitare SDS precipitazione. NOTA: Il protocollo utilizza una serie di incubazione in tampone di pH diversi e contenenti diverse quantità di sali e detergenti sequenzialmente estrarre proteine ​​intracellulari e arricchire per proteine ​​ECM insolubili (Figura 1, Tabella 1, vedi anche la discussione di alternative all'uso del kit commerciale dettagliato qui). I volumi di reagenti indicati di seguito sono per 100 mg di tessuti o tumori (vedi Tabella 1) e devono essere regolati in modo appropriato. Omogeneizzare 100 mg di tessuto in 500 pl di tampone C contenenti inibitori della proteasi utilizzando un omogeneizzatore tessuto finché il tessuto è completamente interrotto e una sospensione omogeneo. NOTA: Aggiungere deossiribonucleasi I (concentrazione finale: 200 mg / ml, ricostituito secondo le istruzioni del produttore) e ribonucleasi A (concentrazione finale: 20 mg / ml, ricostituito secondo le istruzioni del produttore) aBuffer N. L'estrazione sequenziale di proteine ​​solubili intracellulari Estrazione di proteine ​​citosoliche. Incubare l'omogeneizzato su un rotatore tubo per 20 min a 4 ° C. Salva una piccola aliquota (10 ml a 20 ml) del omogenato per la successiva analisi western blot (vedi attesi sezione Risultati e Figura 2). Centrifugare l'omogeneizzato a 16.000 xg per 20 minuti a 4 ° C. Raccogliere il supernatante in una provetta pulita, questo costituirà la citosolico (C) frazione del western blot. Flash congelare questa frazione e conservare a -80 ° C. Per lavare, risospendere il pellet in 400 ml di tampone W contenente inibitori delle proteasi e incubare il campione su un rotatore tubo per 20 min a 4 ° C. Centrifugare l'omogeneizzato a 16.000 xg per 20 minuti a 4 ° C. Scartare il surnatante. Per estrarre, proteine ​​nucleari, risospendere il pellet in 150 ml di tampone N contenenti inibitori della proteasi, deoxyribonuclease io e ribonucleasi A e incubare il campione su un rotatore tubo per 30 minuti a 4 ° C. Centrifugare il campione a 16.000 xg per 30 min a 4 ° C e raccogliere il surnatante in una provetta pulita. Ripetere questo passaggio una volta: dopo centrifugazione del campione per la seconda volta, aggiungere il surnatante al supernatante precedente: questo costituisce il (N) frazione nucleare del western blot. Flash congelare questa frazione e conservare a -80 ° C. Quindi, eseguire lavaggi secondo passo 1.2.3. Per estrarre proteine ​​di membrana, risospendere il pellet in 100 ml di tampone M contenenti inibitori della proteasi e incubare il campione su un rotatore tubo per 30 min a 4 ° C. Centrifugare il campione a 16.000 xg per 30 min a 4 ° C Raccogliere il supernatante in una provetta pulita: questo costituirà la membrana (M) frazione del western blot. Flash congelare questa frazione e conservare a -80 ° C. Per estrarre proteine ​​del citoscheletro, risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone CS contenenti inibitori della proteasi e incubare il campione su un rotatore provetta per 30 minuti a temperatura ambiente. Si noti che il pellet non si dissolverà completamente. Si consiglia di interrompere il pellet pipettando su e giù fino a osservare rottura del pellet. Centrifugare il campione a 16.000 xg per 30 min a RT. Raccogliere il supernatante in una provetta pulita. Notare a questo punto una ulteriore marcata diminuzione delle dimensioni del pellet (vedi video). Risospendere il pellet in 150 ml di tampone C contenente inibitori delle proteasi e incubare il campione su un rotatore tubo per 20 min a 4 ° C. Centrifugare il campione a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e aggiungere al surnatante precedente: questo costituirà il citoscheletro (CS) frazione del western blot. Flash congelare questa frazione e conservare a -80 ° C. Eseguire lavaggi aggiuntivi. Risospendere il pellet in 500 ml di PBS contenente inibitori delle proteasi and incubare il campione su un rotatore provetta per 5 minuti a 4 ° C. Centrifugare il campione a 16.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Scartare il surnatante. Ripetere questa operazione tre volte. NOTA: Tutte le tracce di detergenti deve essere rimosso da ampi lavaggi prima digestione delle proteine ​​in peptidi (vedi punto 3). A questo punto, il pellet ECM arricchito può essere congelati e conservati a -80 ° C. Si noti che le dimensioni del pellet dipenderà dalla quantità di (ECM) proteine ​​insolubili nel materiale di partenza e l'efficienza del decellularization. 2. Monitoraggio della Qualità dei Decellularization / ECM arricchimento mediante SDS-PAGE e Western Blot Mescolare 10-20 ml aliquota dell'estratto del tessuto totale e 50 aliquote microlitri di frazioni intermedie con Laemmli tampone contenente 100 mM DTT. Risospendere il ECM arricchito, frazione insolubile in 3x Laemmli tampone contenente 100 mM DTT. Nota: ha elevato concentrazionidi DTT e SDS contribuire solubilizzazione delle proteine ​​ECM che sono relativamente insolubili. Separare le proteine ​​mediante SDS-PAGE e trasferite su membrane di nitrocellulosa. Eseguire immuno-macchie utilizzando anticorpi per monitorare le proteine ​​rappresentante di ciascuna delle citosolici, nucleare, membrana, citoscheletro e ECM frazioni (vedere la sezione risultati rappresentativi, Tabella 2 e Figura 2). 3. Nella soluzione digestione delle proteine ​​a peptidi per l'analisi Spettrometria di Massa NOTA: Il pellet ottenuto dopo la procedura decellularization e la rimozione della SDS è altamente arricchito in proteine ​​ECM insolubili per ulteriori analisi mediante spettrometria di massa queste proteine ​​devono essere digerito in peptidi. Si noti che, come conseguenza della ECM proteine ​​insolubilità, non è possibile in questa fase per misurare la concentrazione di proteine ​​del campione. Abbiamo così a disposizione volumi di reagenti per digerire l'ECM-enricampioni Ched in peptidi in base alle dimensioni (mm) e il peso secco del pellet ECM arricchito (Tabella 3). Le soluzioni di bicarbonato di ammonio, urea, DTT, iodoacetamide e acido trifluoroacetico tutti devono essere preparati al momento. Risospendere il campione ECM arricchito aggiungendo il volume appropriato di 8 M urea al pellet ECM arricchito e aggiungere DTT ad una concentrazione finale di 10 mM (vedi Tabella 3). Incubare con agitazione continua a 1.400 rpm per 2 ore a 37 ° C. NOTA: a questo punto le proteine ​​ECM non saranno completamente sciolte e le visibilmente grandi particelle proteiche non dovrebbero essere eliminati per centrifugazione o filtrazione. La sospensione sarà chiaro su deglicosilazione e la digestione (vedi video). Alchilazione Preparare la soluzione iodoacetamide in acqua HPLC-grade. Raffreddare il campione a RT e aggiungere il iodoacetamide ad una concentrazione finale di 25 mm. Per una completa alchilazione, DTT: rapporto iodoacetamide deve essere compreso tra 1: 2.5 e 1: 3. Incubare al buio per 30 minuti a RT. Deglycosylation: Nota: deglicosilazione è necessaria per rimuovere catene laterali di carboidrati che interferiscono con l'identificazione di peptidi modificati da N -linked glicosilazione. Diluire a 2 M urea con 100 millimetri di bicarbonato di ammonio a pH 8.0 e aggiungere la giusta quantità di PNGaseF (vedi tabella 3). Incubare con agitazione continua a 1.400 rpm per 2 ore a 37 ° C. Digestione Aggiungere Lys-C e incubare con agitazione continua a 1.400 rpm per 2 ore a 37 ° C. Aggiungere la tripsina e incubare con agitazione continua a 1.400 rpm O / N a 37 ° C. NOTA: la sospensione ricca di ECM che ha avuto inizio nuvoloso dopo la ricostituzione iniziale 8M urea appare chiaro dopo O / N digestione (vedi video). Aggiungere una seconda aliquota di tripsina al campione e incubare con agitazione continua a 1.400 rpm per ulteriori 2 ore a 37 ° C. </ Li> Acidificazione Al termine della digestione, inattivare la tripsina dalla acidificazione del campione con acido trifluoro-acetico 50% preparata di fresco (TFA). Il campione dovrebbe raggiungere pH <2. si consiglia di aggiungere 1-1,5 ml di 50% TFA alla volta e con 1 ml di soluzione di peptide per misurare il pH della soluzione utilizzando carta pH (vedi video). Centrifugare campione acidificato a 16.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante in un tubo a bassa ritenzione pulito. A questo punto, la soluzione peptide può essere conservato a -20 ° C. Desalting Nota: che questo ultimo passo si svolge generalmente in un impianto di spettrometria di massa secondo i propri metodi preferiti. Prima dell'analisi proteomica, desalt i campioni e peptidi eluiti con appena preparato 60% acetonitrile, 0,1% di acido trifluoroacetico, seguita da concentrazione in un concentratore a vuoto. Risospendere i peptidi in preparati al momento 3% acetonitrile, 0,1% di acido trifluoroacetico 8. NOTA: che dopo la dissalazione, la concentrazione della soluzione di peptidi può essere misurata mediante spettrofotometria (vedi sezione risultati attesi). Ora analizzare il campione mediante spettrometria di massa, sempre secondo le modalità ottimali della spettrometria di massa. NOTA: Incoraggiamo i ricercatori interessati a caratterizzare la composizione della ECM usando la spettrometria di massa per fare riferimento alle altre nostre pubblicazioni 8-10 e siti web che forniscono ulteriori spiegazioni, compresi i parametri LC-MS / MS, di massa ricerca dei dati di spettrometria per l'identificazione e l'analisi dei dati delle proteine utilizzando il silico matrisome strumento di annotazione in abbiamo sviluppato 8.

Representative Results

Il controllo di qualità della procedura decellularization L'efficienza del decellularization può essere monitorato analizzando il contenuto proteico di ciascuna frazione mediante western blot. Tabella 2 elenca proteine ​​di valore diagnostico per valutare la qualità della procedura decellularization. La Figura 2A mostra l'estrazione efficiente nelle frazioni intermedie di citosolico (GAPDH ), nucleare (istoni), membrana (β1 integrina) e del citoscheletro (actina) proteine, mentre non proteine ​​ECM (collagene I) viene rilevata in queste frazioni (Figura 2). A sua volta, il pellet finale è arricchito di proteine ​​ECM e largamente impoverito di proteine ​​intracellulari (Figura 2A). Figura 2B presenta soddisfacente proteina intracellulare deplezione (senza istoni viene rilevato nella frazione ricca di ECM), anche se, actina può ancora essere rilevato in la frazione ricca di ECM e l'esaurimento delle monomerico collagene I- Peso molecolare apparente ~ 110 kDa, presumibilmente corrispondente al collagene smontato I – si può osservare nella frazione CS. Inoltre monitoriamo proteine ​​ECM aggiuntivi quali fibronectina e laminina, anche se, in alcuni tessuti questi componenti possono essere parzialmente solubilizzati in frazioni precedenti 8-10. Ad esempio, fibronectina si verifica anche fibronectina plasma solubile che non è incorporato nella ECM. Perfusione del tessuto prima dell'estrazione riduce la concentrazione plasmatica fibronectina ma non sempre eliminarlo. In alcuni tessuti, laminine sono trovato vagamente associata alla superficie cellulare o l'ECM ed estratto in frazioni intermedie. In questo caso può essere affrontato da alterare le condizioni di estrazione (vedi la discussione). Si noti che l'arricchimento di proteine ​​ECM e deplezione concomitante di componenti intracellulari si basa sulla relativa solubilità delle proteine ​​nei diversi buffer. Thè differisce tra diversi tessuti – in alcuni casi le istoni e actina sono più facilmente estratti che in altri. Inoltre noti che, anche se istoni dovrebbero essere estratto nella frazione N (Figura 2B), si osserva spesso una deplezione completa degli istoni nella M o frazione CS (Figura 2A e B). Concentrazione peptide indicativo previsto La concentrazione della soluzione di peptide ottenuto dopo la digestione, acidificazione e dissalazione può essere misurato mediante spettrofotometria o misurando l'assorbanza della soluzione di peptide utilizzando la lunghezza d'onda di 280 nm corrispondente alla triptofano, tirosina, o utilizzando la lunghezza d'onda di 205 nm corrispondente alla assorbanza del peptide obbligazioni. Abbiamo misurato la concentrazione delle soluzioni peptidi ottenuti dalla decellularization di tre polmoni campioni murini (82 mg, 100 mg e 100 mg, rispettivamente) preparosso in parallelo e ottenuto da ciascuno: 424 ng / ml, 450 ng / ml, e 580 ng / ml di peptidi, rispettivamente. Identificazione di peptidi ECM mediante spettrometria di massa Analisi di spettrometria di massa della composizione di campioni di proteine ​​ECM-arricchito, preparati come qui descritto, ha mostrato che> 70% dell'intensità del segnale corrispondente al ECM e proteine ​​ECM-associata 8-10. Tabella 1. Volume di reagenti da kit Compartimentale Estrazione di decellularize 100 mg (peso umido) di tessuto o tumore. Questa tabella elenca la composizione e il volume di ogni buffer utilizzato per condurre la decellularization di 100 mg di tessuto o tumore. Un cocktail di inibitori delle proteasi è fornito come soluzione 50x e deve essere aggiunto ad ogni buffer 2. Reagenti dall'abitacolo estrazione di proteine ​​Kit Volume per 100 mg di tessuto Composizione (sulla base di Millipore datasheet cat # 2145 1) Buffer C 500 microlitri HEPES (pH 7,9 3), MgCl 2, KCl, EDT 4, saccarosio, glicerolo, sodio orthovanadate 5 Buffer W 400 ml HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, saccarosio, glicerolo, sodio orthovanadate Buffer N 150 ml x 2 HEPES (pH 7,9), MgCl 2, NaCl, EDTA, glicerolo, sodio orthovanadate Buffer W 400 ml HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, saccarosio, glicerolo, sodio orthovanadate Buffer M 100 pl HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, saccarosio, glicerolo, sodio desossicolato (DOC) 6, NP-40 6 </sup>, Sodio orthovanadate Buffer CS 200 ml TUBI (pH 6,8), MgCl 2, NaCl, EDTA, saccarosio, sodio Dodecyl solfato (SDS) 7, sodio orthovanadate Buffer C 150 ml HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, saccarosio, glicerolo, sodio orthovanadate 1x PBS 500 microlitri / lavaggio – Note: 1 Per motivi di proprietà, siamo stati in grado di ottenere la composizione precisa dei buffer di fornitura del kit, ma includiamo qui alcune note sulla base della nostra esperienza con tamponi fatti in casa per condurre estrazioni simili. 2 inibitori della proteasi: si consiglia di includere una varietà di inibitori contro cisteina, serina e peptidasi treonina, serina esterasi, metalloproteinasi cationi-dipendente bivalenti etc.Esistono molti cocktail inibitori della proteasi disponibili in commercio. 3 pH superiore a 7.0 è un efficace inibitore di proteasi lisosomiali. 4 EDTA (di solito usato a 2 mm) è un efficace inibitore di proteasi cationi-dipendente bivalenti. 5 sodio orthovanadate è un inibitore della fosfatasi. Una tipica concentrazione efficace sarebbe 0,5-5 mm. 6 NP40 a 0.1% -0.5% è sufficiente a solubilizzare i lipidi di membrana più. La combinazione di NP40 e DOC – spesso utilizzato a concentrazioni uguali (ad esempio, 0,5% per ciascuno) – è spesso usato come una estrazione più rigorosa che lascia ancora molte interazioni proteina-proteina intatto. 7 SDS è un detergente ionico più spinto (CMC 0,1%). Può essere utilizzato anche in combinazione con le altre due detergenti SDS / NP40 / DOC 0,1 / 0,5 / 0,5% come un buffer stringenza intermedio. Tabella 2. proteine ​​diagnostici amonitorare la qualità della procedura decellularization. In questa tabella sono elencati esempi di proteine ​​che sono caratteristiche di ciascun compartimento subcellulare (citosol, nucleo, membrana plasmatica, citoscheletro e ECM) che può essere utilizzato per monitorare la qualità della procedura decellularization e l'efficienza del ECM-arricchimento. Intracellulare Vano Proteine ​​diagnostiche Proteine ​​citosoliche Gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) Proteine ​​nucleari Gli istoni, le lamine, nucleoporin Le proteine ​​di membrana Le integrine, transferrina recettore Proteine ​​del citoscheletro Actina, tubulina, Vimentin Proteine ​​ECM membrana basale Collagene IV, Nidogens, Laminine Proteine ​​ECM interstiziali (interstitial) Collagene I, collagene III, Collagene VI, fibronectina Per raccomandazione su anticorpi, vedere le nostre pubblicazioni 8-10. Tabella 3. Volume di reagenti per digerire campioni ECM arricchito in peptidi. Questa tabella elenca i reagenti utilizzati per sospendere di nuovo campioni di proteine ​​ECM-arricchito e ridurre alchilata, deglycosylate e digerire le proteine ​​dei campioni in peptidi prima di analisi di spettrometria di massa. Reagenti Preparazione Concentrazione Finale / Importo per pellet 1 millimetro di spessore (~ 5-10 mg peso secco) Volume per la pallina 1 millimetro di spessore (~ 5-10 mg peso secco) Bicarbonato di ammonio (NH 4 HCO 3) Soluzione 100 mM in acqua HPLC-grade – – Urea 8 M in soluzione 100 mM di bicarbonato di ammonio 8 M 50 microlitri Ditiotreitolo Ricostituire in acqua HPLC-grade a 500 mm 10 mM 1 ml Iodoacetamide Ricostituire in acqua HPLC-grade a 500 mm 25 MM 2,5 microlitri Peptide- N -Glycosidase F (PNGaseF) Soluzione commerciale a 500 U / mL 1.000 U 2 pl Endoproteinase LysC, spettrometria di massa-grade Ricostituire in acqua HPLC-grade a 0.5 mg / mL 1 mg 2 pl Tripsina, Spettrometria di Massa-grade (turno 1) Soluzione commerciale a 0.5 mg / mL 3 mg 6 ml Tripsina, Spettrometria di Massa-grade (turno 2) Soluzione commerciale a 0.5 mg / mL 1.5 mcg 3 pl L'acido Trifluoro-acetico (TFA) Soluzione al 50% in acqua HPLC – 2-5 microlitri Acetonitrile (eluizione) Soluzione al 60% con 0,1% TFA in acqua per HPLC – 500 microlitri Acetonitrile (ricostituzione) Soluzione 3% con 0,1% TFA in acqua per HPLC – 100 pl Figura 1. Schema della procedura sperimentale. Workflow schematica della protocol per decellularize tessuti (sezione 1), il controllo della qualità del decellularization e valutare l'arricchimento ECM (sezione 2) e digerire campioni di proteine ​​ECM arricchiti in peptidi prima di massa spettrometria (sezione 3). Figura 2. Controllo della qualità della procedura decellularization mediante western blot Western blot sono stati eseguiti su polmone murino (A) e di carcinoma mammario umano xenotrapianto (B) campioni utilizzando i seguenti anticorpi:. Coniglio anti-actina (clone 14-1) e anti coniglio -β1 integrina anticorpi prodotti nel nostro laboratorio; coniglio anti-collagene I, topo anti-GAPDH e anticorpi di coniglio anti-pan-istoni erano da Millipore. Dopo l'incubazione anticorpo primario, le membrane sono state lavate ed incubate in presenza di HRP-coniugato capra anti-coniglio o di capra anti-mouse anticorpo secondario da Jackson ImmunoResearch Laboratory. Infine, le membrane sono state lavate ed incubate a Western lampo ™ chemiluminescenza Reagent (PerkinElmer LAS). * Indica contaminazione istone minima residua della frazione ricca di ECM. ** Indica esaurimento parziale di monomero (presumibilmente da montare) collagene I nella frazione CS. *** Indica la contaminazione actina residuo della frazione ricca di ECM. Il striscio rilevato con l'anticorpo anti-collagene rappresenta diversi livelli di modificazioni post-traduzionali (es, cross-linking, glicosilazione).

Discussion

Modifiche

Anche se abbiamo impiegato questa procedura esatta per arricchire la ECM da dieci tessuti e tipi di tumore 8-10, modifiche del protocollo devono essere considerati nei seguenti casi:

1) Individuazione di proteine ​​ECM nelle frazioni intermedie.

Matrici extracellulari da tessuti diversi o tipi di tumore possono essere diversi nella loro estraibilità / insolubilità, come discusso in precedenza per la fibronectina e laminine. Ad esempio, si ritiene che la ECM di tessuti fibrotici o tessuti rimodellamento gira molto dinamico e quindi si potrebbe osservare una proporzione maggiore di proteine ​​ECM in quei tessuti per essere più prontamente estraibili 12. A seconda della frazione in cui vengono rilevate proteine ​​ECM, si consiglia di ridurre il tempo di incubazione della fase provocando l'estrazione delle proteine ​​ECM o omettendo questo passo.

2) Detection di una percentuale significativa di componenti intracellulari nel pellet ECM-arricchito. In alcuni tessuti o tipi di tumore delle cellule rapporto: ECM è (tumori ad esempio, fegato, milza, non desmoplastici) particolarmente elevati. In tal caso, una contaminazione significativa della frazione ECM arricchita dalle proteine ​​intracellulari (in particolare delle proteine ​​citoscheletriche e / o istoni) può essere osservato. Per esaurire proteine ​​intracellulari in modo efficiente, si consiglia di ripetere gli incubazione in tampone M e / o tampone CS (entrambi i detergenti contenenti, questo di solito impoverisce abbondanti proteine ​​intracellulari). Un'altra alternativa sarebbe quella di utilizzare i buffer alternativi con concentrazioni più elevate di detergenti, con l'avvertenza che questo può portare al depauperamento di proteine ​​ECM relativamente più solubili e (vedi paragrafo successivo).

3) In alternativa al utilizzando un kit commerciale.

Non è stato possibile, per ragioni di proprietà, per ottenere la composizione precisa dei buffer from il fornitore del kit di estrazione delle proteine ​​Compartimentale. Tuttavia, abbiamo incluso nella Tabella 1 note sulla base della nostra esperienza con tamponi fatti in casa con detergente definito (NP-40, sodio desossicolato e SDS) concentrazioni di condurre estrazioni simili. Un recente studio ha inoltre evidenziato l'importanza del pH di buffer decellularization di trattenere proteine ​​ECM 13.

Limitazioni della tecnica

Il metodo qui presentato si basa sul fatto che le proteine ​​ECM sono intrinsecamente più insolubili della maggior parte delle proteine ​​intracellulari. Tuttavia, il metodo descritto qui decellularization certamente estrae componenti solubili presenti nella ECM come alcuni fattori di crescita o enzimi-ECM rimodellamento. Sebbene proteine ​​ECM-associata strettamente legati a proteine ​​ECM sono stati rilevati dal proteomica in campioni preparati come descritto, questo metodo può essere troppo severe al profilo completamente la composizione di matrisome associataproteine.

Importanza della tecnica rispetto ad altri metodi

Il vantaggio del metodo presentato qui rispetto ad altri metodi è che può essere adattata alla natura del ECM di interesse: passaggi intermedi può essere omesso o ripetuta per prevenire la perdita di proteine ​​ECM o aumentare l'esaurimento delle proteine ​​contaminanti intracellulari rispettivamente. Questo metodo utilizza anche solo minime quantità di detergenti che sono risciacquato per evitare la loro interferenza con successiva preparazione peptide e spettrometria di massa. Infine, il metodo descritto qui di digerire preparati proteici ricchi di ECM in peptidi ha anche il vantaggio di non richiedere di essere proteine ​​solubili e possono essere condotti su "grezzi" frazioni ECM-arricchito.

Metodi decellularization alternativi che utilizzano chaotropes (come guanidina cloridrato) per studiare la composizione di ECM mediante spettrometria di massa hanno been riportati in letteratura (rivisto in 14), e sono stati utilizzati in combinazione con la spettrometria di massa per caratterizzare la composizione ECM della cartilagine 15,16, cuore 17, ghiandola mammaria 18 e 19 e vascolare glomerulare 20 membrane basali.

Raccomandazioni

Metodi decellularization impiegano tripsina per digerire le cellule non devono essere utilizzate se ECM sono arricchiti per proteomica successive analisi, come tripsinizzazione si tradurrà in parziale digestione ECM e la perdita di proteine ​​ECM e peptidi. Allo stesso modo, se digestione collagenasi dovesse essere usato per aiutare frammentazione del tessuto, avrebbe bisogno di essere monitorati attentamente provoca ECM digestione e perdita di proteine ​​ECM e peptidi.

In soluzione contro digestione in gel? Proteine ​​ECM sono interconnessi e altamente insolubile e, anche quando risospese in tampone 3x Laemmli (contenente 6% SDS) e 100 mm DTT, po separataOrly su gel SDS. Così in-gel digestione non è un metodo preferito.

Le future applicazioni

Vale la pena notare che, pur non discusso qui, la composizione di ciascuna delle frazioni intermedie raccolti durante la decellularization potrebbe anche essere analizzato mediante spettrometria di massa. Questo può essere particolarmente prezioso quando si studiano campioni molto piccoli (cioè, biopsie umane) oppure quando si desidera informazioni su altre frazioni cellulari.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240 to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.

Materials

Section 1
Tissue homogenizer: Bullet blender + beads Next Advance BB24-AU http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender
Compartmental Extraction kit Millipore 2145 http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145
Deoxyribonuclease I Sigma-Aldrich DN25 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en&region=US
Ribonuclease A Qiagen 19101 http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/
Section 3
HPLC-grade water Sigma-Aldrich 34877 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en&region=US
Urea Sigma-Aldrich U4883 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en&region=US
Dithiotreitol (DTT) Thermo Scientific 20291 http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) Sigma-Aldrich 9830 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en&region=US
Iodoacetamide Sigma-Aldrich A3221 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en&region=US
Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF) New England Biolabs P0704S https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f
Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade  Wako 125-05061 http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm
Trypsin, mass spectrometry-grade  Promega V5111 https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/
Trifluoro-acetic Acid Sigma-Aldrich T6508 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en&region=US
Acetonitrile, mass spectrometry-grade  Thermo Scientific 51101 http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade
Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge Waters 186000383 http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383
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References

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Extracellular MatrixECMDigestionPeptidesMass SpectrometryDecellularizationEnrichmentCross-linked ProteinsGlycosylationBiomarkersDiagnosticTherapeutic Targets

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Naba, A., Clauser, K. R., Hynes, R. O. Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (101), e53057, doi:10.3791/53057 (2015).
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