إثراء خارج الخلية مصفوفة البروتينات من الأنسجة والهضم في الببتيدات لتحليل الطيف الكتلي
Summary
This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.
Abstract
المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي شبكه معقدة من البروتينات عبر ربط تقدم العظة الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية التي هي المنظمين الرئيسية لتكاثر الخلايا، البقاء على قيد الحياة، والهجرة، وما إلى ذلك ECM يلعب دورا هاما في التنمية والأمراض المتنوعة بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية والأمراض العضلي والهيكل العظمي، والتليف والسرطان. وهكذا، واصفا تكوين موبينيل من الأنسجة الطبيعية والمريضة يمكن أن تؤدي إلى التعرف على المؤشرات الحيوية النذير والتشخيص جديدة وأهداف علاجية جديدة محتملة. ومع ذلك، جعلت طبيعة البروتينات ECM (كبيرة الحجم، عبر ربط والمربوطة تساهمي، الغليكوزيلاتي بشكل كبير) التحاليل البيوكيميائية من موبينيل تحديا. للتغلب على هذا التحدي، قمنا بتطوير طريقة لإثراء موبينيل من الأنسجة والأورام الطازجة أو المجمدة التي تستفيد من الذوبان من البروتينات ECM. وصفنا هنا في التفاصيل الإجراء decellularization التي تتكون من أنا متسلسلncubations في مخازن درجة الحموضة المختلفة وتركيز الملح والمنظفات وتكون نتيجتها 1) استخراج داخل الخلايا (عصاري خلوي والطاقة النووية، وغشاء هيكل الخلية) البروتينات و2) إثراء البروتينات ECM. نحن ثم تصف كيفية deglycosylate وهضم البروتين الاستعدادات التخصيب ECM في الببتيدات لتحليلها لاحقا من قبل مطياف الكتلة.
Introduction
المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي شبكه معقدة من البروتينات عبر ربط والغليكوزيلاتي الذي يوفر الدعم المعماري ومرسى للخلايا ويعرف، في جزء منه، خصائص الأنسجة "النشاط الحيوي 1،2. إشارة البروتينات ECM أيضا على الخلايا إما مباشرة من خلال مستقبلاتها (على سبيل المثال، integrins، syndecans، الخ) أو عن طريق تحوير عامل النمو يشير 3. وبالتالي يوفر ECM العظة الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية التي هي المنظمين الرئيسية للعمليات الخلوية مثل انتشار والبقاء، والاستقطاب، والتمايز، والهجرة، الخ
وECM يلعب دورا رئيسيا في علم وظائف الأعضاء والتنمية والشيخوخة 4. وعلاوة على ذلك، وتسبب العديد من الأمراض، مثل أمراض القلب والأوعية الدموية، والتليف، وأمراض العضلي والهيكل العظمي، وأمراض السرطان، من قبل، أو يؤدي إلى والتعديلات ECM. وعلاوة على ذلك، يساهم ECM في الحفاظ على محاريب الخلايا الجذعية وتحديد جزيئات ECM الرئيسية عشرفي دعم stemness سيكون التطبيق المباشر في هندسة الأنسجة والطب التجديدي 5. ومع ذلك، على الرغم من أهميتها، ظلت ECM، حتى وقت قريب، اكتشافها بعد 6.
في سيليكون وقد كشف التحليل أن matrisome، الذي يعرف بأنه مجموعة متكاملة من ECM والبروتينات المرتبطة ECM، ويضم منتجات من عدة مئات من الجينات في كل من الإنسان والفأر الجينوم 1،7،8. ومع ذلك، فإن الذوبان من البروتينات ECM أعاق توصيف منهجي للتكوين في الجسم الحي مصفوفات خارج الخلية من العينات الطبيعية والمرضية. نحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن هذا الذوبان يمكن أن تتحول إلى ميزة ويمكن استخدامها لتخصيب البروتينات ECM 8-10. نحن وغيرنا أثبتت أيضا أن قياس الطيف الكتلي هو الأسلوب المفضل لتوصيف تكوين موبينيل 8-10، 13.
نحنهنا وصف الإجراء decellularization التي تتكون من حضانات متتابعة في مخازن درجة الحموضة المختلفة وتركيز الملح والمنظفات. ويؤدي هذا الإجراء في استخراج (أو استنزاف) من عصاري خلوي والطاقة النووية، وغشاء هيكل الخلية البروتينات وإثراء البروتينات ECM. نحن ثم تصف كيفية هضم البروتين الاستعدادات التخصيب ECM في الببتيدات لتحليلها لاحقا من قبل مطياف الكتلة.
باستخدام الإجراءات التفصيلية ويتضح هنا، لقد أثرى بنجاح وتتميز قياس الطيف الكتلي مصفوفات خارج الخلية من عشرة الأنسجة المختلفة وأنواع الأورام: سرطان الرئة طبيعية الفئران 8 والبشرية والقولون الفئران 8،9، الكبد البشري 9، وأورام القولون والمستقيم الإنسان والمشتقة الانبثاث الكبد 9، xenografts سرطان الجلد 8، xenografts ورم الثدي 10، الجزر البنكرياسية الفئران وinsulinomas الفئران (النبأ آخرون، غير منشورة). مقارنة بين matrisom مختلفةكشفت وفاق التوقيعات ECM نسيجيا وورم محددة من شأنه أن يزيد أن تستخدم المؤشرات الحيوية التشخيص أو النذير المحتملة.
ونحن نعتقد أن هذا الإجراء يمكن تطبيقها على عينات أخرى أو مع أي تعديلات طفيفة نسبيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعديلات
على الرغم من أننا يعمل هذا الإجراء المحدد لإثراء ECM من عشرة الأنسجة وأنواع الأورام 8-10، ينبغي النظر في إدخال تعديلات على بروتوكول في الحالات التالية:
1) الكشف عن البروتينات ECM في الكسور وسيطة.
قد تختلف مصفوفات خارج الخلية من الأنسجة المختلفة أو أنواع الأورام في هم الاستخلاصية / الذوبان، كما نوقش أعلاه لفبرونيكتين وlaminins. على سبيل المثال، يعتقد أن ECM من أنسجة متليفة أو الأنسجة إعادة عرض يقلب حيوي للغاية، وبالتالي يمكن للمرء أن يلاحظ ارتفاع نسبة البروتينات ECM في تلك الأنسجة إلى أن تكون أكثر للاستخراج 12 بسهولة. اعتمادا على جزء التي يتم فيها الكشف عن البروتينات ECM، نقترح تخفيض فترة حضانة الخطوة مما تسبب في استخراج البروتينات ECM أو حذف تلك الخطوة.
2) Detection من نسبة كبيرة من مكونات الخلايا في بيليه التخصيب ECM. في بعض الأنسجة أو أنواع الأورام الخلايا نسبة: ECM هي مرتفعة بشكل خاص (الأورام على سبيل المثال، الكبد، الطحال، غير صلدة). في هذه الحالة، تلوث كبير من الكسر التخصيب ECM من البروتينات داخل الخلايا (خاصة البروتينات هيكل الخلية و / أو الهستونات) ويمكن ملاحظة. في استنزاف البروتينات داخل الخلايا بشكل فعال، فإننا نقترح تكرار مرتين حضانة في مخزن M و / أو عازلة CS (سواء المنظفات التي تحتوي على هذا يستنزف عادة البروتينات داخل الخلايا وفيرة). وثمة بديل آخر يتمثل في استخدام المخازن بديلة مع تركيز المنظفات العليا، مع التحذير من أن ذلك قد يؤدي إلى استنزاف البروتينات ECM أكثر قابلية للذوبان نسبيا وكذلك (انظر الفقرة التالية).
3) البديل لاستخدام عدة التجارية.
كنا قادرين، لأسباب الملكية، للحصول على التركيب الدقيق للمخازن جيئة وذهابام المورد من المجزئ عدة استخراج البروتين. ومع ذلك، أدرجنا في الجدول الملاحظات 1 بناء على تجربتنا الخاصة باستخدام مخازن محلية الصنع مع المنظفات محددة (NP-40، deoxycholate الصوديوم وSDS) تركيزات لإجراء عمليات الاستخراج مماثلة. أبرزت دراسة حديثة أيضا على أهمية الرقم الهيدروجيني للمخازن decellularization للاحتفاظ البروتينات ECM 13.
القيود المفروضة على تقنية
الطريقة المعروضة هنا تعتمد على حقيقة أن البروتينات ECM هي في جوهرها غير قابلة للذوبان أكثر من معظم البروتينات داخل الخلايا. ومع ذلك، وصفت طريقة decellularization هنا مقتطفات بالتأكيد المكونات القابلة للذوبان الموجودة داخل ECM مثل بعض عوامل النمو أو إنزيمات إعادة عرض ECM. وعلى الرغم من الكشف عن البروتينات المرتبطة ECM بإحكام للبروتينات ECM التي كتبها البروتينات في عينات أعد كما هو موضح، قد تكون هذه الطريقة الصارمة جدا لمحة تماما تكوين المرتبطة matrisomeالبروتينات.
أهمية هذه التقنية فيما يتعلق بأساليب أخرى
الاستفادة من الطريقة المعروضة هنا خلال وسائل أخرى هي أنه يمكن أن يكون متلائما مع طبيعة ECM من الفائدة: الخطوات الوسيطة يمكن حذف أو تكرار للحيلولة دون فقدان البروتينات ECM أو زيادة استنزاف وتلويث البروتينات داخل الخلايا على التوالي. هذا الأسلوب أيضا يستخدم سوى كميات ضئيلة من المنظفات التي تشطف لمنع التداخل مع إعداد الببتيد لاحق ومطياف الكتلة. وأخيرا، فإن الطريقة الموصوفة هنا لهضم الاستعدادات البروتين ECM الغنية إلى ببتيدات أيضا لديه ميزة لا تتطلب البروتينات لتكون قابلة للذوبان، ويمكن أن تجرى على "الخام" كسور التخصيب ECM.
طرق decellularization بديلة باستخدام chaotropes (مثل غوانيدين هيدروكلوريد) لدراسة تكوين موبينيل التي كتبها الطيف الكتلي وبذكرت التابعين في الأدب (إعادة النظر في 14) واستخدمت في تركيبة مع مطياف الكتلة لتحديد تكوين ECM الغضروف 15،16، 17 القلب، الغدة الثديية 18 و 19 و الأوعية الدموية الكبيبي 20 الأغشية الطابق السفلي.
توصيات
طرق Decellularization توظيف التربسين الهضم خارج الخلايا لا ينبغي ان تستخدم اذا كان يتم إثراء موبينيل لالبروتينات اللاحقة التحليلات، كما trypsinization سيؤدي في الهضم الجزئي ECM وفقدان البروتينات ECM والببتيدات. وبالمثل، إذا كانت كولاجيناز الهضم لاستخدامها لمساعدة اختلال الأنسجة، وأنها تحتاج إلى الرصد الدقيق لأنه يسبب ECM الهضم وفقدان البروتينات ECM والببتيدات.
في مقابل حل الهضم في جل؟ البروتينات ECM هي عبر ربط وغير قابلة للذوبان للغاية، وحتى عندما معلق في المخزن 3X Laemmli (التي تحتوي على 6٪ SDS) و100MM DTT، ص منفصلأورلي على المواد الهلامية SDS. وهكذا في جل الهضم ليس الأسلوب المفضل.
التطبيقات المستقبلية
تجدر الإشارة إلى أنه في حين لم تناقش هنا، ويمكن أيضا أن يتم تحليلها وتكوين كل من الكسور المتوسطة التي تم جمعها خلال decellularization بواسطة مطياف الكتلة. قد يكون هذا قيمة خاصة عند دراسة عينات صغيرة جدا (أي الخزعات الإنسان) أو عند الرغبة المعلومات حول الكسور الخلوية الأخرى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240 to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.
Materials
| Section 1 | |||
| Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender |
| Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145 |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en®ion=US |
| Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/ |
| Section 3 | |||
| HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en®ion=US |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en®ion=US |
| Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en®ion=US |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en®ion=US |
| Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f |
| Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm |
| Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/ |
| Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en®ion=US |
| Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade |
| Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 | http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383 |
References
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome–an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (1), a004903 (2012).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nat Nanotechnol. 6 (1), 13-22 (2011).
- Wilson, R. The extracellular matrix: an underexplored but important proteome. Expert Rev Proteomics. 7 (6), 803-806 (2010).
- Naba, A., Hoersch, S., Hynes, R. O. Towards definition of an ECM parts list: an advance on GO categories. Matrix Biol. 31 (7-8), 371-372 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Hoersch, S., Liu, H., Carr, S. A., Hynes, R. O. The matrisome: in silico definition and in vivo. characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol. Cell Proteomics. 11 (4), M111.014647 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Whittaker, C. A., Carr, S. A., Tanabe, K. K., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver. BMC Cancer. 14 (1), 518 (2014).
- Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, e01308 (2014).
- Naba, A., Ding, H., Whittaker, C. A., Hynes, R. O., et al. Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Mol. Cell Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).
- Tsuchiya, T., Balestrini, J. L., Mendez, J. J., Calle, E. A., Zhao, L., Niklason, L. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 20 (12), 1028-1036 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Humphries, M. J. Defining the extracellular matrix using proteomics. Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).
- Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics. Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).
- Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. F. Proteomic analysis of mouse growth plate cartilage. Proteomics. 6 (24), 6549-6553 (2006).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Doménech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. In. Heart Proteomics: Methods and Protocols. 1005, 215-223 (2013).
- Hansen, K. C., Kiemele, L., et al. An in-solution ultrasonication-assisted digestion method for improved extracellular matrix proteome coverage. Mol. Cell Proteomics. 8 (7), 1648-1657 (2009).
- Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta. Mol. Cell Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).
- Lennon, R., Byron, A., et al. Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix. J. Am. Soc. Nephrol. 25 (5), 939-951 (2014).
