This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.
hücre dışı matris (ECM) ECM kardiyo-vasküler de dahil olmak üzere gelişme ve çeşitli patolojilerin önemli roller oynadığı hücre proliferasyonu, canlılığı, göç, vb önemli regülatörleri olan, biyofiziksel ve biyokimyasal işaretler sağlamaktadır çapraz bağlı proteinlerin kompleks bir ağ örgüsü olan ve kas-iskelet sistemi hastalıkları, fibrozis, ve kanser. Bu nedenle, normal ve hastalıklı dokuların ECM'lerin bileşiminin karakterize yeni bir prognostik ve tanısal biyolojik ve potansiyel yeni terapötik hedeflerin tanımlanmasına yol açabilir. Ancak, ECM proteinleri doğası (boyutu büyük çapraz bağlı ve kovalent bağlı, ağır glıkosıle) zorlu ECMs biyokimyasal analizler hale gelmiştir. Bu zorluğu aşmak için, ECM proteinlerinin çözünmezliği yararlanır taze veya dondurulmuş doku ve tümörlerden ECMs zenginleştirmek için bir yöntem geliştirdi. Biz burada detaylı sıralı i oluşur decellularization prosedürü tarifFarklı pH ve tuz ve deterjan konsantrasyonları tamponlarda ncubations ve 1'de sonuçlar) hücre içi (sitozolik, nükleer, membran ve sitoskeletal) protein ve ECM proteinleri 2) zenginleştirme çıkarma. Biz o zaman deglycosylate ve kütle spektrometresi ile sonraki analiz için peptidler içine ECM-zenginleştirilmiş protein hazırlıklarını sindirimi nasıl açıklar.
hücre dışı matris (ECM) kısmen, hücreler ve parametreler için mimari destek ve tutunması çapraz bağlanmış ve glikosile edilmiş proteinler, dokuların biyomekanik özellikleri 1,2 karmaşık bir ağ örgüsü olan. ECM proteinleri de hücrelere doğrudan reseptörleri (örneğin, integrinler, syndecans, vs.) ya da 3 Büyüme faktörü sinyal iletiminin düzenlenmesiyle işaret etmektedir. ECM böylece vb çoğalması, yaşam, polarizasyon, farklılaşma, göç gibi hücresel süreçlerin önemli düzenleyicileri biyofizik ve biyokimyasal ipuçları sağlar
ECM fizyolojisi, geliştirme ve 4 yaşlanma kilit roller oynar. Ayrıca, bu tür kalp-damar hastalıkları, fibroz, kas-iskelet hastalıkları, kanser gibi çeşitli patolojiler, neden olduğu ya da ECM değişiklik ile sonuçlanır. Ayrıca, ECM kök hücre nişler bakım katkıda bulunur ve inci anahtar ECM molekülleri tanımlamakDestek stemness doku mühendisliği ve rejeneratif tıp 5 direkt uygulama olacaktır. Ancak, onun önemine rağmen, ECM kalmıştır, yakın zamana kadar, 6 kadar yeterince.
In silico analiz ECM ve ECM ile ilişkili proteinlerin topluluk olarak tanımlanır matrisome, insan ve fare hem de genomlarında 1,7,8 birkaç yüz gen ürünlerini içermesidir olduğunu ortaya koymuştur. Ancak, ECM proteinlerinin çözünmezliği normal ve patolojik numunelerin in vivo hücre dışı matris kompozisyon sistematik karakterizasyonu engellemiştir. 10 – Biz son zamanlarda bu çözünmezliği avantaj döndü olabilir ve ECM proteinler 8 zenginleştirmek için kullanılan gösterdi. 10, 13 – Bu ve diğerleri ayrıca kütle spektrometresi ECMlerin 8 bileşimini karakterize etmek için tercih edilen bir yöntem olup olduğunu göstermiştir.
BizBurada farklı pH ve tuz ve deterjan konsantrasyonları tamponlarda sıralı inkubasyon oluşan bir decellularization prosedürü tarif. Ekstraksiyon (veya tükenmesi) sitozolik, nükleer, membran ve hücre iskeleti proteinleri ve ECM proteinleri zenginleşmesine Bu prosedür sonuçları. Daha sonra kütle spektrometresi ile sonraki analiz için peptidler içine ECM-zenginleştirilmiş protein hazırlıklarını sindirimi nasıl açıklar.
Ayrıntılı ve burada gösterilen prosedürler kullanılarak, başarılı bir şekilde ilave edilen ve kütle spektrometrisi ile karakterize edici özelliği, on farklı doku ve tümör türleri hücre-dışı matrisler: normal fare akciğer 8, insan ve murin kolon 8,9, insan karaciğer 9, insan kolorektal tümörler ve türetilmiş karaciğer metastazı 9, melanom ksenogrefleri 8, (yayınlanmamış Nebe ve ark.,), meme tümörü ksenogrefleri 10, murin pankreas adacık ve murin İnsülinomalar. Farklı matrisom karşılaştırılmasıes başka potansiyel diagnostik veya prognostik biyolojik olarak kullanılabilir doku ve tümöre özgü ECM imza ortaya koymuştur.
Bu prosedür, bir ya da nispeten küçük değişikliklerle, başka örneklerde uygulanabilir olduğuna inanıyoruz.
Değişiklikler
Biz 8 on doku ve tümör tiplerinden ECM zenginleştirmek için bu tam prosedürü istihdam rağmen – 10, protokolün değişiklikler aşağıdaki durumlarda dikkate alınmalıdır:
Ara fraksiyonlardaki ECM proteinleri 1) tespiti.
Fibronektin ve Lamininler için yukarıda tarif edildiği gibi farklı dokular ya da tümör tipleri arasında, hücre dışı matrislerin kendi ekstrakte / çözünmezlik ile farklılık gösterebilir. Örneğin, fibrotik doku ya da yeniden modelleme dokuların ECM ait dinamik üzerinde döner düşünülmektedir ve bu yüzden bir kere daha kolayca 12 ekstrakte olduğu dokularda ECM proteinlerinin daha yüksek bir oran dikkate olabilir. ECM proteinleri tespit edildiği fraksiyonuna bağlı olarak, ECM proteinlerinin çıkarma neden olan veya bu adımı atlayarak aşamasının inkübasyon süresini azaltmak öneriyoruz.
2) DECM-zenginleştirilmiş pelet hücre içi bileşenlerin önemli bir oranda etection. Bazı doku veya tümör tipleri oranı hücreleri içinde: ECM, özellikle yüksek (örneğin, karaciğer, dalak, sigara desmoplastik tümörler) 'dir. Bu durumda, (özellikle sitoskeletal proteinler ve / veya Histonların) hücre içi proteinleri tarafından ECM'nin zenginleştirilmiş fraksiyonun önemli bir kirlenme gözlenebilir. Verimli, biz Tampon M ve / veya Tampon CS (her ikisi de içeren deterjanlar, bu genellikle bol hücre içi proteinleri tüketir) iki kez inkübasyon yinelenen öneririz hücre içi proteinlerin tüketmek. Diğer bir alternatif (bir sonraki paragrafa bakınız), bu da nispeten daha fazla çözünür ECM proteinlerinin tükenmesine neden olabilir bu uyarı ile, daha yüksek deterjan konsantrasyonları alternatif tamponlar kullanmak olacaktır.
Bir ticari kit kullanılarak 3) Alternatif.
Bu ileri geri tampon maddenin kesin bileşimini elde etmek için, özel sebeplerden dolayı, yapamazkomparmantal Protein Ekstraksiyonu kiti tedarikçisi m. Ancak, biz Tablo benzer çekimi yapmak için tanımlanan deterjan ile ev yapımı tamponlar (NP-40, sodyum deoksikolat ve SDS) konsantrasyonları kullanarak kendi deneyimlerine dayanarak 1 notları dahil ettik. Yeni yapılan bir çalışmada da ECM proteinleri 13 korumak için decellularization tamponların pH önemine değindi.
Tekniğin Sınırlamalar
Burada sunulan yöntem, ECM proteinleri özünde daha çözünmez en hücre içi proteinlerin daha olduğu gerçeğine dayanır. Ancak, decellularization yöntemi burada açıklanan kesinlikle böyle bir büyüme faktörleri veya ECM-biçimlenme enzimler gibi ECM içinde bulunan çözülebilir bileşenleri ayıklar. Tarif edildiği gibi sıkı bir şekilde ECM proteinleri bağlı ECM ile ilişkili proteinler hazırlanan örneklerde proteomik ile tespit edilmiştir, ancak, bu yöntem tam olarak bileşimini profil çok katı olabilir matrisome ile ilişkiliproteinler.
Diğer yöntemlere göre tekniğin önemi
ara adımlar ihmal edilebilir ya da ECM protein kaybını önlemek ya da sırasıyla, hücre içi proteinlerin kirletici tükenmesi geliştirmek için tekrarlanır: diğer yöntemlere göre, burada sunulan yöntemin avantajı, ilgi ECM doğasına uygun olmasıdır. Bu yöntem, aynı zamanda, sadece takip eden peptid hazırlanması ve kütle spektrometrisi ile etkileşimi önlemek için kapalı durulanır deterjan az miktarda kullanılır. Son olarak, peptidlere ECM zengin protein preparatları sindirimi için tarif edilen yöntem aynı zamanda proteinler çözünür ve sanayide "ham" ECM zenginleştirilmiş fraksiyonları üzerinde yapılabilir gerekmeyen avantajına sahiptir.
(Örneğin, guanidin hidroklorür gibi) çaotroplar kullanan alternatif decellularization yöntemleri kütle spektrometresi ile ECM'lerin kompozisyon incelemek için b vareen (14 gözden) literatürde bildirilen ve kıkırdak 15,16, kalp 17, meme bezi 18 ve damar 19 ve glomerüler 20 temel zarların ECM bileşiminin karakterize edilmesi için kütle spektrometresi ile kombinasyon halinde kullanılmıştır.
Öneriler
ECM analiz takip eden proteomik için zenginleştirilmiştir halinde tripsinizasyon kısmen ECM sindirim ve ECM protein ve peptid kaybına neden olacak şekilde hücreleri sindirimi tripsin kullanılarak Decellularization yöntemleri, kullanılmamalıdır. Kollajenaz sindirim dokusu bozulması yardım için kullanılacak olsaydı ECM sindirim ve ECM protein ve peptid kaybına neden olur Benzer şekilde, dikkatle takip edilmesi gerekir.
Gelen çözeltisi genel olarak jel sindirim? ECM proteinleri 3x Laemmli tampon maddesi içinde yeniden süspansiyon haline getirildi bile ve 100 mM DTT, ayrı bir PO (% 6 SDS ihtiva eden), çapraz bağlanmış ve yüksek çözünürlüğü olan veSDS jelleri üzerinde orly. Böylece-jel sindirim tercih edilen bir yöntem değildir.
Gelecekteki uygulamalar
Burada tartışılan olmasa da, decellularization sırasında toplanan ara fraksiyonların her birinin kompozisyonu da kütle spektrometresi ile analiz edilebilir, dikkati çekiyor. Çok küçük bir numune (örneğin, insan biyopsileri) ya da eğitim Bu, özellikle yararlı olabilir bilgileri, diğer hücresel fraksiyonları üzerinde arzu edilir.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240 to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.
Section 1 | |||
Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender |
Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145 |
Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en®ion=US |
Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/ |
Section 3 | |||
HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en®ion=US |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en®ion=US |
Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt |
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en®ion=US |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en®ion=US |
Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f |
Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm |
Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/ |
Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en®ion=US |
Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade |
Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 | http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383 |