Обогащение белков внеклеточного матрикса из тканей и пищеварения в пептидов для анализа масс-спектрометрии

Примечание: Эта процедура может быть проведена на свежих или замороженных флэш тканей. Мы рекомендуем перфузии тканей высоко васкуляризированных с PBS в момент вскрытия устранить эритроциты и белки плазмы. Мы не рекомендуем проводить процедуру на фиксированных тканей, как фиксации (т.е., химическое сшивание) мешает decellularization, а также может значительно компромисс последующее масс-спектрометрического анализа. Для всей процедуры, мы рекомендуем использовать недорогим хранения труб и наконечники пипеток, чтобы максимизировать белка и пептид восстановление. 1. Decellularization тканей или опухолей ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом подготовки реагентов и добавить ингибиторы протеазы (поставляется с комплектом белка Добыча ящиком) до желаемого объема каждого буфера. Все буферы и образцы должны храниться на льду в течение всего срока эксперимента, за исключением буфера CS, которая должна быть при комнатной температуре, чтобы предотвратить SDS осадковitation. ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол использует ряд инкубации в буферах различных рН и содержащий различное количество солей и моющих средств, чтобы последовательно извлекать внутриклеточные белки и обогащают для нерастворимых белков ECM (рисунок 1, таблица 1; см также обсуждение альтернатив с использованием коммерческий набор подробно здесь). Объемы реагентов, приведенные ниже, могут быть 100 мг тканей или опухолей (таблица 1) и должны быть скорректированы соответствующим образом. Однородный 100 мг ткани в 500 мкл буфера C, содержащих ингибиторы протеазы с использованием гомогенизатора тканей, пока ткань не полностью нарушена, и гомогенную суспензию получают. ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить дезоксирибонуклеаза я (конечная концентрация: 200 мкг / мл, восстановленный в соответствии с инструкциями завода-изготовителя) и рибонуклеазы A (конечная концентрация: 20 мкг / мл, восстановленный в соответствии с инструкциями завода-изготовителя) наБуфер Н. Последовательное извлечение внутриклеточных растворимых белков Добыча цитозольными белков. Инкубируйте гомогената на трубке ротатора в течение 20 мин при 4 ° С. Сохранить небольшую аликвоту (10 мкл до 20 мкл) гомогената для последующего Вестерн-блот-анализа (см раздел ожидаемых результатов и рисунок 2). Центрифуга гомогената при 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С. Собирают супернатант в чистую пробирку, это будет означать цитозольной (C) фракцию Вестерн-блот-анализа. Вспышка заморозить эту долю и хранить при температуре -80 ° C. Мыть, ресуспендируют осадок в 400 мкл буфера, содержащего W ингибиторы протеазы и инкубируют образец на трубке ротатора в течение 20 мин при 4 ° С. Центрифуга гомогената при 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С. Удалите супернатант. Чтобы извлечь, ядерные белки, ресуспендируют осадок в 150 мкл буфера N, содержащих ингибиторы протеазы, deoxyribonucleaсебе я и рибонуклеазы и инкубировать образец на трубке ротатора в течение 30 мин при 4 ° С. Центрифуга образца при 16000 х г в течение 30 мин при 4 ° С и собирают супернатант в чистую пробирку. Повторите этот шаг один раз: после центрифугирования образца во второй раз, добавить супернатант с предыдущим супернатанта: это будет представлять собой ядерный (N) фракцию Вестерн-блот-анализа. Вспышка заморозить эту долю и хранить при температуре -80 ° C. Затем выполните стирок, как за шагом 1.2.3. Чтобы извлечь мембранные белки, ресуспендируют осадок в 100 мкл буфера M, содержащих ингибиторы протеазы и инкубируют образец на трубке ротатора в течение 30 мин при 4 ° С. Центрифуга образца при 16000 х г в течение 30 мин при 4 ° C Собирают супернатант в чистую пробирку: это будет представлять собой мембрану (М) фракцию Вестерн-блот-анализа. Вспышка заморозить эту долю и хранить при температуре -80 ° C. Чтобы извлечь белки цитоскелета, ресуспендируют осадок в 200 мкл буфера CS, содержащие ингибиторы протеазы и инкубируют образец на трубке ротатора в течение 30 мин при комнатной температуре. Следует отметить, что осадок не будет полностью растворяются. Мы не рекомендуем нарушая гранул с помощью пипетки вверх и вниз до тех пор, наблюдая разрушение гранул. Центрифуга образца при 16000 х г в течение 30 мин при комнатной температуре. Собирают супернатант в чистую пробирку. Примечание в этот момент на дальнейшее заметное снижение размера гранул (см видео). Ресуспендируют осадок в 150 мкл буфера C, содержащего ингибиторы протеаз и инкубировать образец в трубке ротатора в течение 20 мин при 4 ° С. Центрифуга образца при 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С. Соберите супернатант и добавить его к предыдущему супернатанта: это будет представлять собой цитоскелета (CS) часть западной блоттинга. Вспышка заморозить эту долю и хранить при температуре -80 ° C. Выполнение дополнительных моет. Ресуспендируют осадок в 500 мкл PBS, содержащим ингибиторы протеазй инкубировать образец на трубке ротатора в течение 5 мин при 4 ° С. Центрифуга образца при 16000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалите супернатант. Повторите этот шаг три раза. Примечание: Все следы моющих средств должны быть удалены путем промывки обширных до переваривания белков до пептидов (см раздел 3). В этот момент, ЭБУ обогащенного осадок может быть быстро замораживали и хранили при -80 ° С. Обратите внимание, что размер гранул зависит от количества нерастворимых (ECM) белков в исходном материале и эффективности decellularization. 2. Мониторинг качества Decellularization / ECM обогащение SDS-PAGE и вестерн-блоттинга Смешайте 10-20 мкл аликвоты общей экстракта ткани и 50 мкл аликвоты промежуточных фракций с буфера Лэммли, содержащим 100 мМ ДТТ. Ресуспендируют ECM-обогащенный, нерастворимой фракции в 3х Laemmli буфер, содержащий 100 мМ DTT. Примечание: он повышенные концентрацииДТТ и SDS помочь в солюбилизации белков ЕСМ, которые относительно нерастворимы. Отдельные белки электрофорезом в ДСН-ПААГ и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Выполните иммунные пятна с использованием антител для мониторинга белки представителя каждого из цитоплазмы, ядерные, мембранных, цитоскелета и ECM фракций (см представителя раздел результаты, таблица 2 и рисунок 2). 3. В-решения Переваривание белков в пептидов для анализа масс-спектрометрии Примечание: Осадок, полученный после процедуры decellularization и удалени ДДС является сильно обогащены нерастворимых белков ЕСМ для дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии эти белки должны быть переварены в пептидов. Следует отметить, что, как следствие ECM белок нерастворимости, это не возможно на этом этапе, чтобы измерить концентрации белка в пробе. Таким образом, мы предоставляем объемы реагентов, чтобы переварить ECM-ЭнриCHED образцы пептидов в зависимости от размера (мм) или сухого веса ECM обогащенного гранулы (таблица 3). Растворы бикарбоната аммония, мочевины, DTT, иодацетамидом и трифторуксусной кислоты все должны быть свежеприготовленным. Ресуспендируют ECM обогащенного образца добавлением соответствующего объема 8 М мочевины с ECM обогащенного гранулы и добавить DTT при конечной концентрации 10 мМ (таблица 3). Инкубируют при непрерывном перемешивании при 1400 оборотах в минуту в течение 2 ч при 37 ° С. Примечание: в этой точке белков ЕСМ не будет полностью растворяется и заметно большие белковые частицы не должны быть отброшены центрифугированием или фильтрацией. Подвеска будет очистить от дегликозилирования и пищеварения (см видео). Алкилирование Подготовка иодацетамидом решение в ВЭЖХ-класса воды. Охлаждают образец до комнатной температуры и добавить иодацетамида до конечной концентрации 25 мМ. Для полного алкилирования, ДТТ: Отношение иодацетамид должно быть от 1: 2.5 и 1: 3. Инкубируют в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. Дегликозилирование: Примечание: дегликозилирование нужно удалить углеводные боковые цепи, которые мешают идентификации пептидов, модифицированных N -связанной гликозилирование. Развести до 2 М мочевины с 100 мМ бикарбоната аммония рН 8,0 и добавляют соответствующее количество помощью PNGазы F (таблица 3). Инкубируют при непрерывном перемешивании при 1400 оборотах в минуту в течение 2 ч при 37 ° С. Пищеварение Добавить Lys-C и инкубируют при непрерывном перемешивании при 1400 оборотах в минуту в течение 2 ч при 37 ° С. Добавить трипсина и инкубируют при непрерывном перемешивании при 1400 оборотах в минуту O / N при 37 ° С. ПРИМЕЧАНИЕ: ECM-богатых подвеска, которая стала облачно при первоначальном восстановлении в 8М мочевины становится ясно после вывода / N пищеварения (см видео). Добавить вторую аликвоту трипсина на образец и инкубируют при непрерывном перемешивании при 1400 оборотах в минуту в течение дополнительных 2 ч при 37 ° С. </ LI> Подкисление После завершения пищеварения, инактивации трипсина путем подкисления образца с свежеприготовленного 50% трифторуксусной кислоты (TFA). Образец должен достичь рН <2. Мы предлагаем добавить 1-1,5 мкл 50% ТФК в то время, и с помощью 1 мкл раствора пептида, чтобы измерить рН раствора с помощью рН бумаги (см видео). Центрифуга подкисленного образца при 16000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Соберите супернатант в чистую низкой удерживающей трубы. В этот момент, пептидный раствор можно хранить при -20 ° С. Обессоливание Примечание: что этот последний шаг, как правило, проводится при массовом учреждении спектрометрии в соответствии с их собственными предпочтительных способах. Перед анализом протеомики, обессоливания образцы и пептиды элюировали свежеприготовленного 60% ацетонитрила, 0,1% трифторуксусной кислоты, с последующим концентрированием в вакууме концентратора. Ресуспендируют пептидов в свежеприготовленный 3% acetonitrIle, 0,1% трифторуксусной кислоты 8. Примечание: что после обессоливания, концентрация раствора пептида может быть измерена с помощью спектрофотометрии (см раздел ожидаемых результатов). Теперь анализировать образец методом масс-спектрометрии, снова в соответствии с процедурами, оптимальных средств массовой спектрометрии объекта. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем исследователей, заинтересованных в характеризующая состав ЕСМ с помощью масс-спектрометрии для обозначения других наших публикаций 8 – 10 и веб-сайт, которые обеспечивают дальнейшее подробное объяснение, в том числе параметров LC-MS / MS, масс-спектрометрия поиска данных для идентификации белков и анализа данных используя в кремнии matrisome аннотации инструмент, который мы разработаны 8.