This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.
Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein komplexes Geflecht von vernetzten Proteinen, die biophysikalische und biochemische Signale, die wichtigsten Regulatoren der Zellproliferation, Überleben, Migration, etc. sind die ECM spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung und in diverse Pathologien einschließlich Herz-Kreislauf bietet und Muskel-Skelett-Erkrankungen, Fibrose und Krebs. Somit charakterisieren die Zusammensetzung ECMs von normalen und erkrankten Geweben könnte zur Identifizierung neuer prognostische und diagnostische Biomarker und potentielle neue therapeutische Targets führen. Allerdings hat die Natur des ECM-Proteine (groß, vernetzt und kovalent gebunden, stark glykosyliert) biochemische Analysen der ECMs anspruchs gerendert. Um diese Herausforderung zu meistern, eine Methode, um ECMs von frischem oder gefrorenem Gewebe und Tumoren, die Vorteile der Unlöslichkeit von ECM-Proteinen führt zu bereichern entwickelten wir. Wir beschreiben hier im Detail die Dezellularisierung Prozedur, die von aufeinanderfolgenden i bestehtncubations in Puffern mit verschiedenen pH und Salz und Detergens-Konzentrationen und die Ergebnisse in 1) die Extraktion von intrazellulären (cytosolische, Kernmembran und Zytoskelett) Proteine, und 2) die Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen. Wir beschreiben nun, wie deglycosylieren verdauen ECM angereicherte Proteinzubereitungen in Peptide für die anschließende Analyse durch Massenspektrometrie.
Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein komplexes Geflecht aus vernetztem und glycosylierte Proteine, die architektonische Unterstützung und Ankerplatz für Zellen und definiert bietet, zum Teil, Gewebe 'biomechanischen Eigenschaften 1,2. ECM-Proteine Signale auch auf den Zellen entweder direkt durch ihre Rezeptoren (zB Integrinen Syndecane usw.) oder durch Modulieren Wachstumsfaktor-Signalisierungs 3. Das ECM stellt somit biophysikalische und biochemische Signale, die wichtigsten Regulatoren der zellulären Prozessen wie Proliferation, Überleben, Polarisation, Differenzierung, Migration, etc. sind
Das ECM spielt eine Schlüsselrolle in der Physiologie, Entwicklung und Alterung 4. Darüber hinaus sind mehrere Pathologien wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Fibrose, Muskel-Skelett-Erkrankungen, Krebserkrankungen, hervorgerufen durch oder führen, ECM Veränderungen. Außerdem trägt die ECM für die Aufrechterhaltung der Stammzellnischen und die Identifizierung von wichtigen ECM-Moleküle thUnterstützung bei stemness haben direkten Anwendung im Tissue Engineering und der regenerativen Medizin 5. Trotz seiner Bedeutung hat die ECM blieb bis vor kurzem underexplored 6.
In-silico-Analyse ergab, daß das matrisome, definiert als die Gesamtheit der ECM und ECM-assoziierten Proteinen umfasst, die Produkte von mehreren hundert Genen sowohl in der Human- und Maus-Genom 1,7,8. Allerdings hat die Unlöslichkeit ECM Proteine die systematische Charakterisierung der Zusammensetzung der in vivo extrazellulären Matrizen von normalen und pathologischen Proben behindert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass diese Unlöslichkeit könnte wandte sich vorteilhaft eingesetzt werden und verwendet werden, um ECM-Proteine bereichern 8 – 10. Wir und andere weiter gezeigt, daß die Massenspektrometrie ein Verfahren der Wahl, um die Zusammensetzung zu charakterisieren ECMs 8 – 10, 13.
Wirbeschreiben hier eine Dezellularisierung Prozedur, die von aufeinanderfolgenden Inkubationen in Puffern unterschiedlicher pH-Wert und Salzkonzentrationen und Reinigungsmittel besteht. Dieses Verfahren resultiert in der Extraktion (oder Verarmung) cytosolischer, Kernmembran und Zytoskelettproteine und die Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen. Wir beschreiben nun, wie ECM-angereicherten Proteinzubereitungen in Peptide für die anschließende Analyse durch Massenspektrometrie verdauen.
Unter Verwendung der Verfahren detailliert und hier dargestellt, haben wir erfolgreich angereichert und durch Massenspektrometrie die extrazelluläre Matrix aus zehn verschiedenen Geweben und Tumorarten: normal Mäuselunge 8, humanen und murinen Colon 8,9, menschliche Leber 9, menschlichen kolorektalen Tumoren und abgeleiteten Leber-Metastasen 9, Melanom Xenotransplantate 8, Mammatumor-Xenotransplantaten 10. murine Pankreasinseln und murine Insulinom (Nabas et al., unveröffentlicht). Der Vergleich der verschiedenen matrisomes ergab gewebe- und tumorspezifischen ECM Signaturen weiterhin als mögliche diagnostische oder prognostische Biomarker verwendet werden könnten.
Wir glauben, daß dieses Verfahren auch für andere Proben ohne oder mit nur relativ geringfügigen Modifikationen angewandt werden.
Änderungen
Obwohl wir verwendet genau dieses Verfahren, um das ECM aus zehn Gewebe und Tumorarten bereichern 8 – 10, Änderungen des Protokolls sollte in den folgenden Fällen in Betracht gezogen werden:
1) Nachweis der ECM-Proteine in den Zwischenfraktionen.
Extrazelluläre Matrices aus unterschiedlichen Geweben oder Tumorarten können in ihrer Extrahierbarkeit / Unlöslichkeit unterscheiden, wie oben für Fibronektin und Laminin diskutiert. Beispielsweise wird angenommen, dass das ECM von fibrotischen Geweben oder Umbau Gewebe dreht sehr dynamisch und somit könnte man einen höheren Anteil an extrazellulären Matrixproteinen in diesen Geweben zu beobachten, leichter extrahierbar 12 sein. Abhängig von der Fraktion, in der ECM-Proteinen erkannt werden, schlagen wir die Verringerung der Inkubationszeit der Schritt bewirkt die Extraktion von ECM-Proteine oder Weglassen diesen Schritt.
2) Detection eines erheblichen Teils der intrazellulären Komponenten der ECM angereicherte Pellet. In einigen Geweben oder Tumorarten das Verhältnis Zellen: ECM besonders hoch ist (beispielsweise Leber, Milz, nicht-desmoplastischen Tumoren). In diesem Fall kann eine signifikante Kontaminierung der ECM-angereicherten Fraktion durch intrazelluläre Proteine (insbesondere Zytoskelett-Proteine und / oder Histone) beobachtet werden. Um intrazelluläre Proteine effizient, schlagen wir vor, sich wiederholenden doppelten Inkubation in Puffer M und / oder Puffer CS (beide haltige Reinigungsmittel, dies in der Regel verbraucht reichlich intrazelluläre Proteine) führen. Eine andere Alternative wäre, alternative Puffer mit höherer Detergenzkonzentrationen verwenden, mit dem Vorbehalt, dass dies zum Abbau von relativ löslicheren ECM Proteine sowie führen (siehe nächster Absatz).
3) Alternative zur Verwendung eines kommerziellen Kits.
Wir waren nicht in der Lage, für proprietäre Gründen, die genaue Zusammensetzung der Puffer fro erhaltenm die Lieferanten, der das Protein Extraction Kit Compartmental. Allerdings haben wir in Tabelle 1 Notizen auf der Grundlage unserer eigenen Erfahrungen mit hausgemachten Puffer mit definierten Reinigungsmittel (NP-40, Natriumdesoxycholat und SDS) Konzentrationen ähnliche Extraktionen durchzuführen enthalten. Eine neuere Studie auch auf die Wichtigkeit des pH Dezellularisierung Puffer ECM Proteine 13 beizubehalten.
EINSCHRÄNKUNGEN DER TECHNIK
Das hier vorgestellte Verfahren beruht auf der Tatsache, daß ECM-Proteine sind intrinsisch unlöslich als die meisten intrazellulären Proteinen. Jedoch ist die hier beschriebene Methode Dezellularisierung sicher extrahiert innerhalb des ECM vorliegenden löslichen Bestandteile wie einige Wachstumsfaktoren oder ECM-Umbau Enzyme. Obwohl ECM-assoziierten Proteine fest an ECM Proteine gebunden wurden von Proteomik in Proben, hergestellt wie beschrieben, nachgewiesen, kann dieses Verfahren zu streng sein, um vollständig das Profil der Zusammensetzung matrisome assoziiertenProteinen.
Bedeutung der Technik in Bezug auf andere Verfahren
Der Vorteil der hier gegenüber anderen Methoden vorgestellten Verfahren ist, dass es auf die Art des ECM von Interesse angepasst werden: Zwischenschritte können entfallen oder wiederholt, um den Verlust von ECM-Proteinen verhindern oder steigern die Depletion von kontaminierenden intrazelluläre Proteine sind. Auch dieses Verfahren verwendet nur minimale Mengen an Waschmittel, die ausgespült werden, um ihre Interferenz mit anschließender Peptidzubereitung und Massenspektrometrie zu verhindern. Schließlich hat die hier beschriebenen ECM-reiche Proteinzubereitungen in Peptide verdaut Verfahren auch den Vorteil, nicht erforderlich Proteine löslich zu sein und kann auf "rohes" ECM-angereicherten Fraktionen durchgeführt werden.
Alternative Verfahren, die Dezellularisierung Chaotropen (wie Guanidin-Hydrochlorid) um die Zusammensetzung der ECMs durch Massenspektrometrie studieren been in der Literatur beschrieben (in 14 überprüft), und wurden in Kombination mit der Massenspektrometrie verwendet, um die ECM-Zusammensetzung Knorpel 15,16, Herz 17, Brustdrüse 18 und Gefäß 19 und 20 glomerulären Basalmembranen charakterisieren.
Empfehlungen
Dezellularisierung Verfahren, die Trypsin zu verdauen aus Zellen sollten nicht verwendet werden, wenn ECM für nachfolgende Proteomik angereichert analysiert werden, wie Trypsinierung wird in Teil ECM Verdauung und Verlust von ECM Proteinen und Peptiden führen. Und falls Kollagenaseverdau sollten verwendet werden, um Gewebe-Zerstörung zu unterstützen, müsste sorgfältig überwacht werden, da es ECM Verdauung und Verlust von ECM-Proteinen und Peptiden verursacht.
In-Lösung gegen In-Gel-Verdauung? ECM-Proteine sind vernetzt und stark unlöslich, und selbst wenn in 3x Laemmli-Puffer (enthaltend 6% SDS) und 100 mM DTT, separate poorly auf SDS-Gelen. Somit im Gel Verdauung ist kein bevorzugtes Verfahren.
Zukünftige Anwendungen
Es ist erwähnenswert, dass, obwohl hier nicht diskutiert, die Zusammensetzung von jedem der Zwischenfraktionen bei der Dezellularisierung gesammelt könnte auch durch Massenspektrometrie analysiert werden. Dies kann besonders nützlich sein, wenn das Studium sehr kleine Proben (dh menschlicher Biopsien) oder, wenn Informationen auf anderen Zellfraktionen gewünscht.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240 to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.
Section 1 | |||
Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender |
Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145 |
Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en®ion=US |
Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/ |
Section 3 | |||
HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en®ion=US |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en®ion=US |
Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt |
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en®ion=US |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en®ion=US |
Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f |
Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm |
Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/ |
Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en®ion=US |
Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade |
Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 | http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383 |