質量分析のためのペプチドに組織および消化から細胞外マトリックスタンパク質の濃縮

脱細胞化手順の品質管理脱細胞化の効率は、ウェスタンブロットにより各分画のタンパク質含有量を分析することによってモニターすることができる。診断価値の表2のタンパク質脱細胞化手順の品質を評価する。 図2Aは、細胞質ゾルの中間の画分における効率的な抽出（GAPDHを示します）、核（ヒストン）、膜（β1インテグリン）と細胞骨格（アクチン）、タンパク質、何のECMタンパク質（コラーゲンI）は、これらの画分に検出されなかったのに対し（ 図2）。ターンでは、最終ペレットは、ECMタンパク質について濃縮されており、主に細胞内タンパク質（ 図2A）が枯渇。アクチンはまだで検出することができる、が、 図2Bは 、（何のヒストンは、ECMに富む画分に検出されない）良好な細胞内タンパク質の枯渇を提示しますECMに富む画分および単量体コラーゲンIの枯渇- 見かけの分子量〜110 kDaの、推定上私が組み立てられていないコラーゲンに対応する – CS画分に観察することができます。 いくつかの組織では、これらのコンポーネントの一部は、以前の画分8-10中に可溶化することができ、が、我々はまた、日常的に、フィブロネクチンおよびラミニンなどの追加のECMタンパク質を監視します。例えば、フィブロネクチンはまた、ECM中に組み込まれていないなどの可溶性血漿フィブロネクチンを発生します。抽出前に組織の灌流は、血漿フィブロネクチン濃度を低下させるが、常にそれを排除しません。いくつかの組織では、ラミニンは緩く、細胞表面または中間留分におけるECMと抽出に関連付けられて発見されました。このような場合には、（説明を参照）、抽出条件を変更することによって対処することができます。 ECMタンパク質や細胞内成分の同時枯渇の濃縮は異なるバッファ中のタンパク質の相対的な溶解性に基づいていることに注意してください。目異なる組織間で異なります – いくつかのケースではヒストンおよびアクチンがより容易に他のものに比べて抽出されます。また、ヒストンがN画分（ 図2B）で抽出されることが期待されているが、我々は多くの場合、MまたはCS画分（ 図2AおよびB）にヒストンのより完全な枯渇を観察する、ということに注意してください。 予想されることを示すペプチド濃度消化、酸性化及び脱塩後に得られたペプチド溶液の濃度は、分光光度法のいずれかによって、トリプトファン、チロシンに相当する280nmの波長を用いてペプチド溶液の吸光度を測定し、またはペプチドの吸光度に対応する205 nmの波長を用いて測定することができます債券。 我々は、（それぞれ、82ミリグラム、100ミリグラム、100ミリグラム）は、3つのマウスの肺サンプルの脱細胞化から得られたペプチド溶液の濃度を測定しprepa424 ng /μLで、450 ng /μLであり、それぞれのペプチドの580 ng /μLで：赤を並列にし、それぞれから得られます。 質量分析によるECMペプチドの同定ここに記載のように調製ECMに富むタンパク質サンプルの組成の質量分析は、信号強度の> 70％がECMとECM関連タンパク質8-10に対応することを示しました。 組織または腫瘍の100 mgの（湿重量）を脱細胞化するためのコンパートメント抽出キットからの試薬 ​​の表1巻。この表は、組成物および組織または腫瘍の100ミリグラムの脱細胞化を行うために使用される各バッファの容量を示しています。プロテアーゼインヒビターのカクテルは、50倍溶液として提供し、各バッファ2に追加する必要があります。 コンパートメントタンパク質抽出キットからの試薬 100mgの組織のボリューム 組成物（ミリポアデータシートカタログ番号に基づいて、2145 1） 緩衝液C 500μlの HEPES（pHが7.9 3）、 塩化マグネシウム、塩化カリウム、EDT 4、スクロース、グリセロール、ナトリウムオルトバナジン5 バッファW 400μlの HEPES（pHは7.9）、 塩化マグネシウム、塩化カリウム、EDTA、スクロース、グリセリン、ナトリウムオルトバナジンバッファN 150μlの×2 HEPES（pHは7.9）、 塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、EDTA、グリセロール、ナトリウムオルトバナジンバッファW 400μlの HEPES（pHは7.9）、 塩化マグネシウム、塩化カリウム、EDTA、スクロース、グリセリン、ナトリウムオルトバナジンバッファM 100μlの HEPES（pHは7.9）、 塩化マグネシウム、塩化カリウム、EDTA、スクロース、グリセロール、デオキシコール酸ナトリウム（DOC）6、NP-40 6 </sup>、ナトリウムオルトバナジンバッファCS 200μlの PIPES（pHは6.8）、 塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、EDTA、スクロース、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）7、ナトリウムオルトバナジン緩衝液C 150μlの HEPES（pHは7.9）、 塩化マグネシウム、塩化カリウム、EDTA、スクロース、グリセリン、ナトリウムオルトバナジン 1×PBS 500μL/ウォッシュ – 注意事項 ： 1は、独自の理由から、我々は、キットの供給者からのバッファの正確な組成物を得ることができなかったが、私たちはここに同様の抽出を行うために自家製のバッファを使用して、私たち自身の経験に基づいて、いくつかの注意事項があります。 2プロテアーゼ阻害剤：それはなど 、システイン、セリンおよびトレオニンペプチダーゼ、セリンエステラーゼ、二価カチオン依存性メタロに対する阻害剤の様々なを含めることをお勧めします多くの市販のプロテアーゼ阻害剤カクテルが存在します。 7.0以上のpHを3は、リソソームプロテアーゼの有効な阻害剤です。 （通常は2 mmに使用される）4 EDTAは、二価カチオン依存性プロテアーゼの有効な阻害剤です。 5オルトバナジン酸ナトリウムは、ホスファターゼ阻害剤です。典型的な有効濃度は0.5〜5 mMであろう。 0.1％-0.5％で6 NP40は、ほとんどの膜脂質を可溶化するのに十分です。 NP40とDOCの組み合わせは-多くの場合、まだ無傷の多くのタンパク質-タンパク質相互作用を残すより厳しい抽出として使用されている-多くの場合（ 例えば 、それぞれの0.5％）が等しい濃度で使用されます。 7 SDSは、より厳しいイオン性界面活性剤（CMC 0.1％）です。また、他の二つの界面活性剤SDS / NP40 / DOC中間ストリンジェンシーバッファーとして0.1 / 0.5 / 0.5％と組み合わせて使用​​することができます。 表2.診断タンパク質へ脱細胞化手順の品質を監視する。この表では、脱細胞化手順の質と効率をモニターするために使用することができ、各細胞内区画（細胞質ゾル、核、原形質膜、細胞骨格およびECM）の特徴であるタンパク質の例を示しECM-濃縮。 細胞内区画 診断タンパク質 サイトゾルタンパク質グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH） 核タンパク質ヒストン、ラミン、ヌクレオポリン膜タンパク質インテグリン、トランスフェリン受容体細胞骨格タンパク質アクチン、チューブリン、ビメンチン基底膜のECMタンパク質 IV型コラーゲン、Nidogens、ラミニン間質ECMタンパク質（間質） コラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンVI、フィブロネクチン抗体上の勧告については、当社の出版物8-10を参照してください。 ペプチドへECMに富む試料を消化するための試薬 ​​の表3巻。この表は、ECMに富むタンパク質試料を再懸濁し、減らす、アルキレート、脱グリコシル化および質量分析の前にペプチドにタンパク質試料を消化するために使用される試薬を示しています。 試薬 準備 厚さ1mmのペレットのための最終的な濃度/量（〜5〜10mgの乾燥重量） 厚さ1mmのペレットのボリューム（〜5〜10mgの乾燥重量） 重炭酸アンモニウム（NH 4 HCO 3） HPLCグレードの水中の100 mM溶液 – – 尿素 100mMの重炭酸アンモニウム中の8M溶液 8 M 50μlのジチオスレイトール 500 mmにHPLCグレードの水に再構成 10 mMの 1μL ヨードアセトアミド 500 mmにHPLCグレードの水に再構成 25 mMの 2.5μL ペプチドN -Glycosidase F（PNGアーゼF） 500 U /μLで商用ソリューション千U 2μL エンドプロテアーゼのLysC、質量分析グレード 0.5μgの/μLでHPLCグレードの水に再構成 1μgの 2μL トリプシン、質量分析グレード（ ラウンド1） 0.5μgの/μLで商用ソリューション 3μgの 6μL トリプシン、質量分析グレード（ ラウンド2） 0.5μgの/μLで商用ソリューション 1.5μgの 3μL トリフルオロ酢酸（TFA） HPLC等級の水中の50％溶液 – 2-5μL アセトニトリル（ 溶出 ） HPLC等級の水中の0.1％TFAで60％溶液 – 500μlのアセトニトリル（ 再構成 ） HPLC等級の水中の0.1％TFAで3％溶液 – 100μlの 実験手順の図1のスキーム。protocoの概略ワークフローlは、組織（第1節）を脱細胞化脱細胞化の品質を制御し、ECM濃縮（第2節）を評価し、質量分析（第3節）の前にペプチドにECMに富むタンパク質試料を消化します。 ウェスタンブロットによる脱細胞化手順を図2品質管理ウェスタンブロットを、マウス肺（A）およびヒト乳癌異種移植片（B）以下の抗体を使用して、サンプルに対して実施した：ウサギ抗アクチン（クローン14-1）およびウサギ抗我々の研究室で作製し-β1インテグリン抗体;ウサギ抗コラーゲンI、マウス抗GAPDHウサギ抗汎ヒストン抗体はMillipore社から入手しました。一次抗体のインキュベーション後、膜を洗浄し、HRP結合ヤギ抗ウサギまたはヤギ抗MOUの存在下でインキュベートしジャクソンイムノリサーチ研究所から南東に二次抗体。最後に、膜を洗浄し、ウェスタンライトニング™化学発光試薬（パーキンエルマーLAS）中でインキュベートしました。 * ECMに富む画分の微小残存ヒストン汚染を示しています。 ** CS画分中の単量体（推定的組み立てられていない）コラーゲンIの部分的な減少を示しています。 *** ECMに富む画分の残留アクチン汚染を示しています。抗コラーゲン抗体を用いて検出したスミアは、翻訳後修飾（ 例えば、架橋結合、グリコシル化）の異なるレベルを表しています。