This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.
De extracellulaire matrix (ECM) is een complex maaswerk van verknoopte eiwitten die biofysische en biochemische signalen die belangrijke regulatoren van celproliferatie, overleving, migratie, etc. Het ECM speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling en in diverse pathologieën waaronder hart- en voorziet en aandoeningen van het bewegingsapparaat ziekten, fibrose en kanker. Aldus karakteriseren van de samenstelling van ECM's van normale en zieke weefsels kunnen leiden tot de identificatie van nieuwe prognostische en diagnostische biomarkers en potentiële nieuwe therapeutische doelwitten. Echter, de aard van ECM eiwitten (groot in omvang, verknoopt en covalent gebonden, zwaar geglycosyleerd) biochemische analyse van ECM uitdagende gesmolten. Om deze uitdaging te overwinnen, ontwikkelden we een methode om ECM verrijken van verse of diepgevroren weefsels en tumoren die gebruik maakt van de onoplosbaarheid van ECM eiwitten. We beschrijven hier in detail de cellen ontdoen procedure die bestaat uit opeenvolgende incubations in buffers van verschillende pH en zout en afwasmiddel concentraties en dat resulteert in 1) de winning van intracellulaire (cytosolisch, nucleaire, membraan en cytoskelet) eiwitten en 2) de verrijking van ECM eiwitten. Vervolgens beschrijven we hoe deglycosylate en te verteren-ECM verrijkt eiwitpreparaten in peptiden voor verdere analyse door middel van massaspectrometrie.
De extracellulaire matrix (ECM) is een complex maaswerk verknoopt en geglycosyleerde eiwitten die bouwkundige ondersteuning en verankering van cellen en definieert bepaalt gedeeltelijk biomechanische eigenschappen weefsels "1,2. ECM eiwitten ook signaal aan de cellen hetzij direct via hun receptoren (bijvoorbeeld integrinen syndecans, enzovoort) of door het moduleren groeifactor signalering 3. De ECM geeft dus biofysische en biochemische signalen die belangrijke regulatoren van cellulaire processen zoals proliferatie, overleving, polarisatie, differentiatie, migratie, etc.
De ECM speelt een belangrijke rol in de fysiologie, ontwikkeling en veroudering 4. Bovendien verschillende pathologieën, zoals hart- en vaatziekten, fibrose, spier-skelet ziekten, kanker, veroorzaakt door of resulteren in ECM wijzigingen. Bovendien is de ECM bijdraagt tot de instandhouding van stamcelniches vastgelegd en de belangrijkste ECM moleculen thop steun stemness zal directe toepassing in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde 5 hebben. Ondanks het belang ervan, is de ECM gebleven tot voor kort onderbelichte 6.
In silico analyse is gebleken dat de matrisome, gedefinieerd als het geheel van ECM en ECM-geassocieerde eiwitten omvat de produkten van honderden genen in zowel het menselijke genoom en de muis 1,7,8. Echter, de onoplosbaarheid van ECM eiwitten systematische karakterisering van de samenstelling van in vivo extracellulaire matrices van normale en pathologische monsters belemmerd. We hebben onlangs aangetoond dat deze onoplosbaarheid kan worden gedraaid voordelig worden gebruikt voor ECM proteïnen verrijken 8-10. Wij en anderen verder aangetoond dat massaspectrometrie is een voorkeurswerkwijze voor de samenstelling van ECM's te karakteriseren 8 – 10, 13.
Webeschrijf hier een decellularisatie procedure die bestaat uit opeenvolgende incubaties in buffers van verschillende pH en zout en afwasmiddel concentraties. Deze procedure resulteert in de extractie (of depletie) cytosolisch, nucleaire membraan en cytoskeleteiwitten en verrijking van ECM eiwitten. Vervolgens beschrijven we hoe ECM-verrijkte eiwitpreparaten verteren in peptiden voor verdere analyse door middel van massaspectrometrie.
De gedetailleerde procedures en hier weergegeven hebben we met succes verrijkt en gekenmerkt met massaspectrometrie de extracellulaire matrices uit tien verschillende weefsels en soorten tumoren Normale muizen long 8, menselijke en murine colon 8,9, humane lever 9, humane colorectale tumoren en afgeleide levermetastasen 9, melanoom xeno-transplantaten 8, mammaire tumor xenotransplantaten 10 van muis pancreaseilandjes en murine insulinomen (Naba et al., ongepubliceerd). Vergelijking van de verschillende matrisomes geopenbaard weefsel- en tumorspecifieke ECM handtekeningen die verder kan worden gebruikt als potentiële diagnostische of prognostische biomarkers.
We geloven dat deze procedure kan worden toegepast op andere monsters zonder of met relatief kleine aanpassingen.
Wijzigingen
Hoewel we in dienst deze exacte procedure om de ECM verrijken van tien weefsel en tumor types 8-10, dienen wijzigingen van het protocol te worden beschouwd in de volgende gevallen:
1) Detectie van ECM eiwitten in de tussenliggende fracties.
Extracellulaire matrix van verschillende weefsels of tumorsoorten kunnen verschillen in hun extraheerbaarheid / onoplosbaarheid, zoals hierboven besproken voor fibronectine en lamininen. Bijvoorbeeld wordt aangenomen dat de ECM van fibrotische weefsels of verbouwen weefsels keert zeer dynamisch en daardoor zou men zich aan een groter deel van ECM eiwitten in die weefsels gemakkelijker extraheerbaar 12 zijn. Afhankelijk van de fractie waarin ECM eiwitten worden gedetecteerd, stellen we het verminderen van de incubatietijd van de trede waardoor de winning van ECM eiwitten of weglaten van deze stap.
2) Detection van een aanzienlijk deel van intracellulaire componenten in de ECM-verrijkte pellet. In sommige weefsels of tumorsoorten de verhouding cellen: ECM is bijzonder hoog (bijvoorbeeld lever, milt, non-desmoplastisch tumoren). In dat geval kan een aanzienlijke verontreiniging van het ECM-verrijkte fractie door intracellulaire eiwitten (met name cytoskelet proteïnen en / of histonen) worden waargenomen. Om intracellulaire eiwitten efficiënt, raden we herhalen tweemaal de incubatie in buffer M en / of Buffer CS (beide met detergenten, deze put meestal overvloedige intracellulaire eiwitten) afbreken. Een ander alternatief zou zijn om alternatieve buffers met hogere concentraties detergent, met het voorbehoud dat dit kan leiden tot de uitputting van relatief beter oplosbaar ECM eiwitten en (zie volgende paragraaf).
3) Methode voor het gebruik van een commerciële kit.
We waren niet in staat om eigen redenen om de precieze samenstelling van de buffers weer te verkrijgenm de leverancier van de Compartimentele Protein Extraction kit. We hebben echter in Tabel 1 toelichting basis van eigen ervaring met zelfgemaakte buffers met gedefinieerde detergens (NP-40, natriumdeoxycholaat en SDS) concentraties vergelijkbare extracties voeren. Een recente studie benadrukt ook het belang van de pH van decellularisatie buffers aan ECM eiwitten 13 te behouden.
Beperkingen van de techniek
De hier gepresenteerde methode berust op het feit dat ECM eiwitten intrinsiek niet oplosbaar dan de meeste intracellulaire eiwitten. Echter, hier beschreven de decellularisatie methode zeker onttrekt oplosbare componenten aanwezig binnen de ECM zoals sommige groeifactoren of-ECM remodeling enzymen. Hoewel ECM-geassocieerde eiwitten nauw verbonden met ECM eiwitten werden gedetecteerd door proteomics in monsters bereid zoals beschreven kan deze werkwijze te streng zijn volledig het profiel van de samenstelling van matrisome geassocieerdeeiwitten.
Betekenis van de techniek met betrekking tot andere methoden
Het voordeel van de hier gepresenteerde boven andere methoden werkwijze is dat deze kan worden aangepast aan de aard van de ECM plaats: tussenstappen kunnen worden overgeslagen of herhaald om het verlies van ECM eiwitten voorkomen of verhogen uitputting van respectievelijk verontreinigende intracellulaire eiwitten. Deze werkwijze gebruikt ook slechts minimale hoeveelheden detergentia die worden afgespoeld hun interferentie met latere peptide preparaat en massaspectrometrie voorkomen. Ten slotte is de hier beschreven ECM-rijke eiwitten te verteren preparaten in peptiden methode heeft ook het voordeel dat er geen eiwitten oplosbaar en kunnen worden uitgevoerd op "eenvoudige" ECM-verrijkte fracties.
Alternatieve werkwijzen die gebruik maken van cellen ontdoen chaotrope middelen (bijvoorbeeld guanidine hydrochloride) de samenstelling van ECM door massaspectrometrie bestuderen bEen gerapporteerd in de literatuur (besproken in 14) en zijn gebruikt in combinatie met massaspectrometrie de ECM samenstelling van kraakbeen 15,16, hart 17, borstklier 18 en vasculaire 19 en 20 glomerulaire basale membranen karakteriseren.
Aanbevelingen
Decellularisatie werkwijzen die gebruik trypsine verteerbaar uit cellen mag niet worden gebruikt wanneer ECM's worden verrijkt voor daaropvolgende proteomics analyses, zoals trypsine resulteert in partiële digestie ECM en verlies van ECM eiwitten en peptiden. Evenzo, als collagenase digestie zou worden gebruikt weefselverstoring steun, zou zorgvuldig moeten worden gevolgd zoals veroorzaakt ECM vertering en verlies van ECM eiwitten en peptiden.
In water dan in-gel digestie? ECM eiwitten zijn verknoopt en hoogst onoplosbaar, zelfs wanneer geresuspendeerd in 3 x Laemmli buffer (die 6% SDS) en 100 mM DTT, aparte poOrly op SDS gels. Dus in-gel digestie geen voorkeur.
Toekomstige toepassingen
Opgemerkt zij dat, hoewel hier niet besproken, de samenstelling van elk van de halfproducten tijdens het van cellen ontdoen verzameld kan ook worden geanalyseerd door massaspectrometrie. Dit kan met name waardevol zijn bij het bestuderen van zeer kleine monsters (bijvoorbeeld, menselijke biopsies) of achterhaalde informatie gewenst andere celfracties.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240 to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.
Section 1 | |||
Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender |
Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145 |
Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en®ion=US |
Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/ |
Section 3 | |||
HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en®ion=US |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en®ion=US |
Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt |
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en®ion=US |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en®ion=US |
Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f |
Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm |
Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/ |
Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en®ion=US |
Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade |
Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 | http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383 |