This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.
La matrice extracellulaire (MEC) est un maillage complexe de protéines réticulées qui fournit des indices biophysiques et biochimiques qui sont d'importants régulateurs de la prolifération cellulaire, la survie, la migration, etc. L'ECM joue un rôle important dans le développement et dans diverses pathologies, notamment cardio-vasculaires et des maladies musculo-squelettiques, de la fibrose, et le cancer. Ainsi, la caractérisation de la composition des ECM de tissus normaux et malades pourrait conduire à l'identification de nouveaux biomarqueurs pronostiques et diagnostiques et de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Cependant, la nature même de protéines ECM (grandes en taille, réticulés et liés de manière covalente, fortement glycosylée) a rendu des analyses biochimiques de ECM difficile. Pour surmonter ce défi, nous avons développé une méthode pour enrichir ECM à partir de tissus et de tumeurs fraîches ou congelées qui tire parti de l'insolubilité des protéines de la MEC. Nous décrivons ici en détail la procédure de décellularisation qui se compose de i séquentiellencubations dans des tampons de différents pH et des concentrations de sel et de détergent et qui se traduit par une extraction de la) intracellulaire (cytoplasmique, nucléaire, membrane et du cytosquelette) les protéines et 2) l'enrichissement de protéines de la MEC. Nous décrivons ensuite comment deglycosylate et digérer préparations de protéines ECM enrichie en peptides pour l'analyse ultérieure par spectrométrie de masse.
La matrice extracellulaire (ECM) est un maillage complexe de protéines réticulés et glycosylatées qui fournit un soutien architectural et d'ancrage pour les cellules et définit, en partie, des propriétés biomécaniques de tissus 1,2. protéines ECM signalent également les cellules, soit directement à travers leurs récepteurs (par exemple, les intégrines, syndécanes, etc.) ou par une modulation du facteur de croissance de signalisation 3. L'ECM fournit ainsi des signaux biophysiques et biochimiques qui sont d'importants régulateurs de processus cellulaires tels que la prolifération, la survie, la polarisation, la différenciation, la migration, etc.
L'ECM joue un rôle clé dans la physiologie, le développement et le vieillissement 4. En outre, plusieurs pathologies, comme les maladies cardio-vasculaires, la fibrose, des maladies musculo-squelettiques, les cancers, sont causés par, ou d'entraîner la modification de l'ECM. En outre, l'ECM contribue au maintien de niches de cellules souches et identifier des molécules d'ECM principaux èmeau soutien stemness aura une application directe dans l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative 5. Cependant, malgré son importance, l'ECM est restée, jusqu'à récemment, peu exploré 6.
Analyse in silico a montré que la matrisome, définie comme l'ensemble des ECM et les protéines de l'ECM-associé, comprend les produits de plusieurs centaines de gènes à la fois dans le génome humain et de souris 1,7,8. Cependant, l'insolubilité des protéines de la MEC a entravé la caractérisation systématique de la composition de matrices extracellulaires in vivo des échantillons normaux et pathologiques. Nous avons récemment démontré que cette insolubilité pourrait être mise à profit et être utilisé pour enrichir protéines ECM 8 – 10. Nous et d'autres de plus démontré que la spectrométrie de masse est une méthode de choix pour caractériser la composition d'ECM 8-10, 13.
Nousdécrire ici une procédure de décellularisation qui se compose d'incubations séquentielles dans des tampons de pH différents et des concentrations de sel et de détergent. Ce procédé aboutit à l'extraction (ou déplétion) de protéines cytosoliques, nucléaires, la membrane et du cytosquelette et l'enrichissement de protéines de la MEC. Nous décrivons ensuite comment digérer préparations de protéines ECM enrichie en peptides pour l'analyse ultérieure par spectrométrie de masse.
En utilisant les procédures détaillée et illustrée ici, nous avons réussi à enrichir et caractérisé par spectrométrie de masse des matrices extracellulaires de dix différents tissus et types de tumeurs: poumon normal murin 8, humaine et du côlon murin 8,9, foie humain 9, les tumeurs colorectales humaines et dérivés métastases hépatiques 9, xénogreffes de mélanome 8, xénogreffes tumorales mammaires 10, les îlots pancréatiques murins et murins (Naba insulinomes et al., non publié). Comparaison de l'autre matrisomes révélé signatures ECM Tissue et spécifiques de la tumeur qui pourraient encore être utilisées comme biomarqueurs de diagnostic ou de pronostic potentiels.
Nous croyons que cette procédure peut être appliquée à d'autres échantillons avec ou sans modifications relativement mineures.
Modifications
Bien que nous avons utilisé cette procédure exacte à enrichir l'ECM de dix tissus et types de tumeurs 8 – 10, des modifications du protocole devrait être considérée dans les cas suivants:
1) Détection de protéines de la MEC dans les fractions intermédiaires.
Matrices extracellulaires provenant de différents tissus ou types de tumeurs peuvent différer dans leur extractibilité / insolubilité, comme discuté ci-dessus pour la fibronectine et laminines. Par exemple, on pense que la MEC des tissus ou des tissus fibrotiques remodelage retourne très dynamique et donc on pourrait observer une plus grande proportion de protéines de la MEC dans les tissus d'être plus facilement extractible 12. En fonction de la fraction de protéines de la MEC qui sont détectés, nous suggérons de réduire le temps d'incubation de l'étape consistant à provoquer l'extraction des protéines de la MEC ou omettre cette étape.
2) DÉTECTION d'une partie importante des composants intracellulaires dans le culot enrichi ECM. Dans certains tissus ou types de tumeurs des cellules de rapport: ECM est particulièrement élevées (par exemple, les tumeurs, le foie, la rate, la non-desmoplastiques). Dans ce cas, une contamination importante de la fraction enrichie de l'ECM par des protéines intracellulaires (en particulier des protéines et / ou des histones cytosquelette) peut être observée. Pour épuiser les protéines intracellulaires efficacement, nous vous suggérons de répéter deux fois l'incubation dans le tampon M et / ou tampon CS (les deux détergents contenant, ce épuise généralement abondantes protéines intracellulaires). Une autre alternative serait d'utiliser des tampons de rechange avec des concentrations plus élevées de détergents, avec l'avertissement que cela peut conduire à l'épuisement des protéines ECM relativement plus solubles ainsi (voir paragraphe suivant).
3) Alternative à l'aide d'un kit commercial.
Nous avons été incapables, pour des raisons de propriété, pour obtenir la composition précise des tampons frosuis le fournisseur du kit d'extraction de protéines et compartimentés. Toutefois, nous avons inclus dans le tableau 1 notes basées sur notre propre expérience en utilisant des tampons faits maison avec du détergent défini (NP-40, désoxycholate de sodium et SDS) les concentrations de procéder à des extractions similaires. Une étude récente a également souligné l'importance du pH des tampons de décellularisation de conserver protéines ECM 13.
Limites de la technique
La méthode présentée ici repose sur le fait que les protéines de l'ECM sont intrinsèquement plus insoluble que la plupart des protéines intracellulaires. Cependant, le procédé décrit ici de décellularisation extrait certainement composants solubles présents dans la MEC telles que des facteurs de croissance ou des enzymes de remodelage de la MEC. Bien que les protéines d'ECM associé étroitement liés aux protéines d'ECM ont été détectés par la protéomique dans les échantillons préparés comme décrit, cette méthode peut être trop strictes au profil totalement la composition de matrisome-associéprotéines.
L'importance de la technique par rapport à d'autres méthodes
L'avantage de la méthode présentée ici par rapport aux autres procédés est qu'il peut être adapté à la nature de l'intérêt de l'ECM: les étapes intermédiaires peut être omis ou répété pour empêcher la perte de protéines de la MEC ou augmenter l'épuisement des protéines contaminantes intracellulaires respectivement. Cette méthode utilise également seulement des quantités minimales de produits de lavage qui sont rincés à empêcher leur interférence avec la préparation du peptide suivant et spectrométrie de masse. Enfin, le procédé décrit ici pour digérer les préparations de protéines ECM riche en peptides a également l'avantage de ne pas nécessiter d'être des protéines solubles et peuvent être effectuées sur les fractions enrichies ECM "bruts".
D'autres méthodes de décellularisation en utilisant chaotropes (tels que le chlorhydrate de guanidine) d'étudier la composition des ECM par spectrométrie de masse ont been rapporté dans la littérature (revue dans 14) et ont été utilisés en combinaison avec la spectrométrie de masse pour caractériser la composition de l'ECM du cartilage 15,16, coeur 17, glande mammaire 18 et 19 vasculaire et glomérulaire 20 membranes basales.
Recommandations
méthodes de Décellularisation employant trypsine à digérer sur cellules ne doivent pas être utilisés si ECM sont enrichis pour la protéomique ultérieures analyses, comme la trypsine se traduira par digestion partielle de l'ECM et la perte de protéines et de peptides ECM. De même, si digestion à la collagénase était utilisé pour faciliter une désorganisation du tissu, il serait nécessaire de surveiller attentivement car il provoque ECM digestion et la perte de protéines et de peptides ECM.
En contre-solution la digestion dans le gel? protéines de la MEC sont réticulés et fortement insoluble et, même quand on remet en suspension dans du tampon Laemmli 3x (contenant 6% de SDS) et 100 mM de DTT, po séparéorly sur des gels SDS. Ainsi en est-gel digestion pas un procédé préféré.
Les applications futures
Il est à noter que, bien que non décrit ici, la composition de chacune des fractions intermédiaires recueillies au cours de la décellularisation peut également être analysé par spectrométrie de masse. Cela peut être particulièrement utile lorsque l'on étudie de très petits échantillons (c.-à-biopsies humaines) ou lorsque l'information est demandée sur d'autres fractions cellulaires.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240 to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.
Section 1 | |||
Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender |
Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145 |
Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en®ion=US |
Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/ |
Section 3 | |||
HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en®ion=US |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en®ion=US |
Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt |
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en®ion=US |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en®ion=US |
Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f |
Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm |
Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/ |
Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en®ion=US |
Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade |
Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 | http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383 |