This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.
A matriz extracelular (ECM) é uma malha complexo de proteínas reticuladas que fornece sinais biofísicas e bioquímicas que são importantes reguladores da proliferação celular, sobrevivência, migração, etc. O ECM desempenha papéis importantes no desenvolvimento e em diversas patologias incluindo cardio-vascular e doenças músculo-esqueléticas, fibrose e câncer. Assim, a caracterização da composição de ECMs de tecidos normais e doentes pode levar à identificação de novos marcadores de prognóstico e de diagnóstico e terapêuticas potenciais alvos. No entanto, a própria natureza das proteínas da MEC (grandes em tamanho, com ligações cruzadas e ligados covalentemente, fortemente glicosilada) tornou análises bioquímicas de ECMs desafiador. Para superar este desafio, desenvolvemos um método para enriquecer ECMs a partir de tecidos e tumores frescos ou congelados que tira proveito da insolubilidade das proteínas da MEC. Nós descrevemos aqui em pormenor o procedimento decellularization que consiste em i seqüencialncubations em tampões de diferente pH e concentrações de sal e de detergente e que resulta em 1) a extracção de intracelular (citosólica, nuclear, membrana do citoesqueleto e) proteínas e 2) o enriquecimento de proteínas da MEC. Em seguida, descrevem como deglycosylate e digerir preparações de proteína enriquecido com ECM em peptídeos para posterior análise por espectrometria de massa.
A matriz extracelular (ECM) é uma malha complexa de proteínas reticulado e glicosiladas que fornece suporte de arquitetura e de ancoragem para as células e define, em parte, as propriedades biomecânicas de tecidos 1,2. Proteínas ECM também um sinal para as células, quer directamente através dos seus receptores (por exemplo, integrinas, sindecans, etc.) ou através da modulação do factor de crescimento de sinalização 3. A ECM fornece, assim, sinais biofísicas e bioquímicas que são importantes reguladores de processos celulares tais como a proliferação, a sobrevivência, a polarização, diferenciação, migração, etc.
O ECM desempenha papel fundamental na fisiologia, desenvolvimento e envelhecimento 4. Além disso, várias patologias, como doenças cardio-vascular, fibrose, doenças músculo-esqueléticas, cânceres, são causadas por, ou resultar em alterações de ECM. Além disso, o ECM contribui para a manutenção de nichos de células-tronco e a identificação de moléculas de ECM chave thno apoio stemness terá aplicação directa em engenharia de tecidos e medicina regenerativa 5. No entanto, apesar da sua importância, o ECM manteve-se, até recentemente, pouco explorado 6.
Em silico análise revelou que o matrisome, definido como o conjunto de ECM e proteínas associadas à ECM, compreende os produtos de várias centenas de genes nos genomas tanto a humanos e de ratinho 1,7,8. No entanto, a insolubilidade das proteínas da MEC tem dificultado a caracterização sistemática da composição in vivo de matrizes extracelulares de espécimes normais e patológicas. Nós recentemente demonstrado que esta insolubilidade poderia ser transformado em vantagem e ser usado para enriquecer proteínas ECM 8-10. Nós e outros ainda demonstrado que a espectrometria de massa foi um método de escolha para caracterizar a composição de ECMs 8-10, 13.
NósDescrevemos aqui um procedimento decellularization que consiste em incubações sequenciais em buffers de diferentes pH e concentrações de sal e detergentes. Este procedimento resulta na extracção (ou depleção) de proteínas citosólicas, nucleares, da membrana e do citoesqueleto e o enriquecimento de proteínas da MEC. Em seguida, descrevemos como digerir preparações de proteína enriquecido com ECM em peptídeos para posterior análise por espectrometria de massa.
Utilizando os procedimentos detalhado e ilustrado aqui, temos enriquecido com sucesso e caracteriza-se por espectrometria de massa das matrizes extracelulares de dez diferentes tecidos e tipos de tumores: pulmão normal murino 8, humanos e de cólon murino 8,9, fígado humano 9, tumores colorretais humanos e derivados metástases hepáticas 9, xenoenxertos de melanoma 8, xenotransplantes tumorais mamárias 10, ilhotas pancreáticas murinas e insulinomas murino (Naba et al., não publicado). Comparação das diferentes matrisomES revelou assinaturas ECM para tecidos e específicos de tumores que podem ainda ser utilizados como biomarcadores potenciais de diagnóstico ou de prognóstico.
Acreditamos que este procedimento pode ser aplicado a outros espécimes sem ou relativamente pequenas modificações.
Modificações
Apesar de termos utilizado esse procedimento exato para enriquecer o ECM a partir de dez tecidos e tipos de tumores 8-10, modificações do protocolo devem ser consideradas nos seguintes casos:
1) Detecção de proteínas de ECM nas fracções intermédias.
Matrizes extracelulares a partir de diferentes tecidos ou tipos de tumores podem diferir na sua extractabilidade / insolubilidade, como discutido acima para a fibronectina e lamininas. Por exemplo, pensa-se que a ECM de tecidos fibróticos ou tecidos remodelação vira muito dinamicamente e, portanto, pode-se observar uma maior proporção de proteínas de ECM nos tecidos a ser mais facilmente extraível 12. Dependendo da fracção no qual são detectadas proteínas da MEC, sugerimos a reduzir o tempo de incubação do passo provocando a extracção de proteínas de ECM ou omitindo este passo.
2) Detection de uma proporção significativa de componentes intracelulares no sedimento enriquecido em ECM. Em alguns tecidos ou tipos de tumor As células de relação: ECM é particularmente elevadas (por exemplo, tumores, do fígado, do baço, não desmoplásicas). Nesse caso, uma contaminação significativa da fracção enriquecida em ECM por proteínas intracelulares (em particular, proteínas do citoesqueleto e / ou histonas) podem ser observadas. Para esgotar as proteínas intracelulares de forma eficiente, sugerimos repetindo duas vezes a incubação em tampão H e / ou tampão CS (ambos contendo detergentes, este geralmente esgota abundantes proteínas intracelulares). Outra alternativa seria a utilização de tampões alternativos com concentrações mais elevadas de detergentes, com a ressalva de que isso pode levar ao esgotamento das proteínas da MEC relativamente mais solúveis, bem como (veja o próximo parágrafo).
3) alternativa à utilização de um kit comercial.
Não foi possível, por razões de propriedade, para se obter a composição precisa dos buffers frosou o fornecedor do kit de extração de proteínas compartimental. No entanto, nós incluímos na Tabela 1 notas com base em nossa própria experiência usando buffers caseiros com detergente definido (NP-40, desoxicolato de sódio e SDS), as concentrações para realizar extrações similares. Um estudo recente também destacou a importância do pH de buffers de decelularização para reter proteínas da MEC 13.
Limitações da técnica
O método aqui apresentado baseia-se no facto de as proteínas de ECM são intrinsecamente mais insolúvel do que a maioria das proteínas intracelulares. No entanto, o método de descelularização descrito aqui certamente extrai os componentes solúveis presentes dentro da ECM, tais como alguns factores de crescimento ou enzimas-remodelação de ECM. Embora proteínas associadas a ECM firmemente ligados a proteínas da MEC foram detectados por proteómica em amostras preparadas como descrito, este método pode ser muito rigorosa ao perfil totalmente a composição de associados-matrisomeproteínas.
Significância da técnica em relação a outros métodos
A vantagem do método apresentado aqui em relação a outros métodos é que ele pode ser adaptado à natureza do ECM de interesse: passos intermédios podem ser omitidos ou repetidos para evitar a perda de proteínas de ECM ou aumentar a depleção de proteínas contaminantes intracelulares respectivamente. Este método também utiliza apenas quantidades mínimas de detergentes que são enxaguados para evitar a sua interferência com a preparação de péptidos subsequente e espectrometria de massa. Finalmente, o método descrito aqui para digerir preparações de proteína rica em ECM em peptídeos tem também a vantagem de não necessitar de proteínas de ser solúvel e pode ser realizado em fracções enriquecidas com ECM "em bruto".
Métodos alternativos de decelularização utilizando agentes caotrópicos (tais como cloridrato de guanidina) para estudar a composição de ECMs por espectrometria de massa têm been relatado na literatura (revisto em 14) e têm sido utilizados em combinação com espectrometria de massa para caracterizar a composição ECM de cartilagem 15,16, 17 coração, glândula mamária 18 e vascular 19 e 20 as membranas basais glomerulares.
Recomendações
Descelularização métodos empregando tripsina para digerir as células não deve ser utilizado se ECMs são enriquecidos para proteómica subsequentes análises, como tripsinização resultará na digestão de ECM parcial e perda de proteínas da MEC e péptidos. Da mesma forma, se a digestão de colagenase foram para ser utilizada para auxiliar rompimento do tecido, ele terá de ser monitorizada cuidadosamente, uma vez que faz com que a digestão e perda de proteínas da MEC e péptidos ECM.
Em solução-vs digestão em gel? Proteínas de ECM são reticulados e altamente insolúveis e, mesmo quando ressuspensas em tampão de Laemmli 3x (contendo 6% de SDS) e 100 mM de DTT, po separadoorly em geles de SDS. Assim, a digestão em gel não é um método preferido.
As aplicações futuras
Vale a pena notar que, enquanto não discutido aqui, a composição de cada uma das fracções de intermediário recolhidos durante a descelularização pode também ser analisados por espectrometria de massa. Isto pode ser particularmente útil quando se estuda amostras muito pequenas (isto é, biópsias humanas) ou quando a informação é desejado em outras fracções celulares.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240 to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.
Section 1 | |||
Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender |
Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145 |
Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en®ion=US |
Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/ |
Section 3 | |||
HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en®ion=US |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en®ion=US |
Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt |
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en®ion=US |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en®ion=US |
Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f |
Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm |
Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/ |
Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en®ion=US |
Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade |
Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 | http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383 |