This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.
מטריקס (ECM) הוא meshwork מורכב של חלבונים צולבים המספק רמזי biophysical וביוכימיים שרגולטורים עיקריים של התפשטות תאים, הישרדות, הגירה, וכו 'ECM משחק תפקידים חשובים בפיתוח ובפתולוגיות שונות, כולל לב וכלי דם ומחלות שרירים ושלד, סיסטיק, וסרטן. לפיכך, המאפיין את ההרכב של ECMS של רקמות בריאות וחולות יכול להוביל לזיהוי של סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים ואבחון חדשניים ומטרות טיפוליות חדשניות פוטנציאל. עם זאת, הטבע מאוד של חלבוני ECM (גדולים בגודל, צולבים וקוולנטית כפותים, glycosylated בכבדות) הפך את הניתוחים ביוכימיים של ECMS המאתגר. כדי להתגבר על האתגר הזה, פיתחנו שיטה להעשרת ECMS מרקמות טריות או קפוא וגידולים שמנצל את insolubility של חלבוני ECM. אנו מתארים כאן בפירוט את הליך decellularization שמורכבת מאני עוקבncubations במאגרים של pH שונה וריכוזי מלח ואבקת כביסה וכי תוצאות 1) הפקת תאית (cytosolic, גרעיני, הקרום וcytoskeletal) חלבונים ו -2) ההעשרה של חלבוני ECM. לאחר מכן, אנו מתארים כיצד deglycosylate ולעכל הכנות חלבון מועשר ECM לפפטידים לניתוח שלאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.
מטריקס (ECM) הוא meshwork מורכב של חלבונים צולבים ומסוכרים שמספקים תמיכה אדריכלית ומעגן לתאים ומגדיר, בחלקו, ביו-המכאניים המאפיינים 'רקמות 1,2. חלבוני ECM גם לאותת לתאים באופן ישיר באמצעות קולטנים (למשל, integrins, syndecans, וכו ') שלהם או על ידי ויסות גורם גדילת איתות 3. ECM כך מספק רמזי biophysical וביוכימיים שרגולטורים עיקריים של תהליכים תאיים כגון התפשטות, הישרדות, קיטוב, בידול, הגירה, וכו '
ECM משחק תפקידי מפתח בפיזיולוגיה, התפתחות והזדקנות 4. יתר על כן, כמה פתולוגיות, כגון מחלות לב וכלי דם, סיסטיק, מחלות שרירים ושלד, סרטן, נגרמות על ידי, או לגרום ל, שינויי ECM. יתר על כן, ECM תורם לשמירה על נישות בתאי גזע וזיהוי מולקולות ECM מפתח הבstemness התמיכה יהיה יישום ישיר בהנדסת רקמות ורפואת רגנרטיבית 5. עם זאת, למרות חשיבותה, ECM נשאר, עד לאחרונה, underexplored 6.
בסיליקון והניתוח גילה כי matrisome, שהוגדר כהרכב של ECM וחלבונים הקשורים ECM, כולל את המוצרים של כמה מאה גנים בגנום האנושי והן עכבר 1,7,8. עם זאת, insolubility של חלבוני ECM הפריע האפיון השיטתי של הרכב in vivo מטריצות תאית של דגימות נורמליות ופתולוגיים. לאחרונה הוכיחו כי insolubility זה יכול להיות הפך ליתרון ולהשתמש בם כדי להעשיר את חלבוני ECM 8 – 10. אנחנו ואחרים נוספים הוכיחו כי ספקטרומטר מסה הייתה שיטה של בחירה לאפיין את ההרכב של ECMS 8 – 10, 13.
אנחנומתאר כאן הליך decellularization שמורכב מincubations רציף במאגרים של pH שונה וריכוזי מלח וחומרי ניקוי. תוצאות הליך זה בחילוץ (או דלדול) של חלבוני cytosolic, גרעיניים, קרום וcytoskeletal וההעשרה של חלבוני ECM. לאחר מכן, אנו מתארים כיצד לעכל הכנות חלבון מועשר ECM לפפטידים לניתוח שלאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.
שימוש בנהלים מפורטים ומאויר כאן, יש לנו מועשר בהצלחה ומאופיינת בספקטרומטר מסת המטריצות תאית מעשר רקמות שונות וסוגי גידולים: ריאות נורמליות עכברית 8, אנושי ומעי גס בעכברי 8,9, כבד אנושי 9, גידולי מעי גס אנושיים ונגזרים גרורות בכבד 9, xenografts מלנומה 8, xenografts החלב גידול 10, איי לבלב בעכברים וinsulinomas עכברי (נאבא et al., לא פורסם). השוואה של matrisom השוניםes חשף חתימות ECM דקיקות ובגידול ספציפי שעוד יכולים לשמש כסמנים ביולוגיים לאבחון או לפרוגנוסטיים פוטנציאליים.
אנו מאמינים כי הליך זה יכול להיות מיושם על דגימות אחרות ללא או קטנים יחסית שינויים.
שינויים
למרות שאנו מועסקים הליך מדויק זה להעשיר את ECM מעשר רקמות וסוגי גידולים 8 – 10, שינויים בפרוטוקול יש לשקול במקרים הבאים:
1) זיהוי של חלבוני ECM בשברי ביניים.
מטריצות תאי מרקמות שונות או סוגי גידולים עשויות להיות שונות בextractability / insolubility, כפי שפורטו לעיל לפיברונקטין וlaminins. לדוגמא, הוא חשב כי ECM של רקמות fibrotic או רקמות שיפוץ מתהפך מאוד דינמי ולכן אפשר להתבונן שיעור גבוה יותר של חלבוני ECM ברקמות אלה להיות יותר בקלות ניתן להפיק 12. בהתאם לחלק שבו חלבוני ECM מזוהים, אנו ממליצים להקטין את זמן הדגירה של הצעד שגרמו למיצוי של חלבוני ECM או השמטת צעד ש.
2) Detection של חלק משמעותי של רכיבים תאיים בגלולה מועשרת ECM. בחלק מרקמות או סוגי גידולי תאי יחס: ECM הוא (גידולים למשל, כבד, טחול, שאינה desmoplastic) גבוהים במיוחד. במקרה זה, זיהום משמעותי של החלק מועשר ECM על ידי חלבונים תאיים (בחלבונים מסוימים cytoskeletal ו / או ההיסטונים) ניתן לצפות. לרוקן את החלבונים תאיים ביעילות, אנו ממליצים לחזור פעמיים הדגירה במאגר M ו / או הצפת CS (שני חומרי הניקוי המכילים, בדרך כלל זה מכלה חלבונים תאיים בשפע). חלופה נוספת תהיה להשתמש מאגרים חלופיים עם ריכוזי אבקת גבוהים יותר, עם האזהרה כי זה עלול להוביל לדלדול של חלבוני ECM יחסית יותר מסיסים וכן (ראה הסעיף הבא).
3) אלטרנטיבי לשימוש בערכה מסחרית.
לא הצליחו, מסיבות קנייניות, כדי לקבל את ההרכב המדויק של המאגרים הלוך ושובמ 'הספק של ערכת חילוץ חלבון הממודרת. עם זאת, יש לנו כלל בטבלה 1 הערות על סמך הניסיון שלנו באמצעות מאגרי תוצרת בית עם חומר ניקוי מוגדר (NP-40, deoxycholate נתרן וSDS) ריכוזים לנהל עקירות דומות. מחקר שנערך לאחרונה גם הדגיש את חשיבותו של ה- pH של מאגרי decellularization לשמור חלבוני ECM 13.
מגבלות של הטכניקה
השיטה המוצגת כאן מסתמכת על העובדה שחלבוני ECM הם מהותי יותר מסיס מאשר רוב החלבונים תאיים. עם זאת, שיטת decellularization מתוארת כאן בהחלט תמציות מרכיבים מסיסים הנוכחיים בתוך ECM כגון כמה גורמי גדילה או אנזימי שיפוץ-ECM. למרות שהחלבונים הקשורים ECM ההדוק לחלבוני ECM אותרו על ידי פרוטאומיקה בדגימות מוכנות כפי שתוארו, שיטה זו עשויה להיות מחמירה מדי לפרופיל ההרכב מלא הקשורים matrisomeחלבונים.
משמעות של הטכניקה ביחס לשיטות אחרות
יתרונה של השיטה שהוצגה כאן על פני שיטות אחרות הוא שזה יכול להיות מותאם לאופי של ECM עניין: ניתן להשמיט צעדי ביניים או חוזר ונשנה, כדי למנוע האובדן של חלבוני ECM או להגדיל את הדלדול של זיהום חלבונים תאיים בהתאמה. שיטה זו משתמשת גם רק כמויות מזעריות של חומרי ניקוי ששטפו כדי למנוע ההפרעה שלהם עם הכנת פפטיד שלאחר מכן וספקטרומטר מסה. לבסוף, בשיטה המתוארת כאן כדי לעכל הכנות חלבון ECM-עשיר לפפטידים יש גם את היתרון של לא דורש חלבונים להיות מסיסים ויכולים להתנהל על שברים מועשרים ECM "גולמיים".
שיטות אלטרנטיביות decellularization ניצול chaotropes (כגון hydrochloride guanidine) ללמוד את ההרכב של ECMS ידי ספקטרומטריית מסה שbeen דווח בספרות (ביקורת ב -14) והיה בשימוש בשילוב עם ספקטרומטריית מסה לאפיין את הרכב ECM של סחוס 15,16, לב 17, בלוטת החלב 18 וכלי דם 19 ו -20 ממברנות מרתף גלומרולרי.
המלצות
אין להשתמש בשיטות decellularization העסקת טריפסין לעכל את תאים אם ECMS מועשר לפרוטאומיקה לאחר ניתוח, כtrypsinization יגרום עיכול ECM חלקי ואובדן חלבוני ECM ופפטידים. באופן דומה, אם עיכול collagenase היה לשמש כדי לסייע שיבוש רקמות, זה היה צריך להיות במעקב צמוד כפי שהוא גורם לעיכול ECM ואובדן חלבוני ECM ופפטידים.
לעומת עיכול בג'ל ב- פתרון? חלבוני ECM הם צולבים ומסיסים מאוד ו, גם כאשר resuspended במאגר 3x Laemmli (המכילים 6% SDS) ו100mm DTT, PO הנפרדאורלי על ג'לי SDS. כך ב- ג'ל עיכול הוא לא שיטה מועדפת.
יישומים עתידיים
ראוי לציין, כי בעוד לא נדון כאן, בהרכב של כל אחד משברי ביניים שנאספו במהלך decellularization יכול גם להיות מנותח על ידי ספקטרומטריית מסה. זה עשוי להיות יקר במיוחד כאשר לומדים מדגמים קטנים מאוד (כלומר, ביופסיות אנושיות) או כאשר מידע רצוי בשברים סלולריים אחרים.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240 to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.
Section 1 | |||
Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender |
Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145 |
Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en®ion=US |
Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/ |
Section 3 | |||
HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en®ion=US |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en®ion=US |
Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt |
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en®ion=US |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en®ion=US |
Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f |
Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm |
Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/ |
Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en®ion=US |
Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade |
Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 | http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383 |