Misura di Smooth funzione muscolare nei isolato carta igienica-applicazioni Farmacologia Research
Summary
This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.
Abstract
Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum – if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.
Introduction
La disciplina di farmacologia ha utilizzato il sistema isolato bagno tessuto per oltre 150 anni. La versatilità di questo sistema ha permesso agli scienziati di tutto il mondo per caratterizzare recettori e del segnale del recettore trasduzione, con questa conoscenza che costituisce la base di terapie che hanno curato milioni di persone con malattie o disturbi come l'ipertensione, insufficienza cardiaca, diabete, malattie gastrointestinali, della vescica disfunzione, asma e disturbi della deglutizione, per citarne solo alcuni. A tutt'oggi, la vasca tessuto isolato rimane un aspetto importante di sviluppo di farmaci e la ricerca di base, in quanto consente il tessuto di funzionare come un tessuto. In questa lezione Giove, un protocollo formale è condivisa a dimostrare un esperimento visivo e virtuale utilizzando i dati di un esperimento isolato carta igienica che misura contrazione isometrica, che permette la caratterizzazione del recettore.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tessuto vive unnd funzioni nel suo complesso tessuto, con esito fisiologica (contrazione o rilassamento) che è rilevante per il corpo. Si tratta di una sintesi di passi (interazione farmaco-recettore, trasduzione del segnale, di seconda generazione messenger, il cambiamento in eccitabilità del muscolo liscio, e modificare in funzione del tessuto). Mentre altre tecniche permettono lo studio di ciascuno di questi passaggi (es radiolegante vincolante per affinità farmaco, la misurazione di secondi messaggeri), isolato tecnica vasca tessuto consente l'integrazione di tutti questi passaggi 1. Un altro vantaggio è che il mantenimento funzione del tessuto consente il calcolo di importanti variabili farmacologici che sono più significativi in un tessuto vs un ambiente cellulare; si avvicina a come i farmaci esaminati funzionerebbero nel corpo nel suo complesso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Misurazione della forza isometrica come strumento di ricerca è di oltre 150 anni, ma continua ad essere la tecnica prototipo per la caratterizzazione dei recettori nei tessuti contrattili 2. La potenza di questa tecnica è nella sua semplicità e versatilità: registrando risposte indotte da concentrazioni crescenti di un agonista in presenza o assenza di un antagonista, una miriade di informazioni può essere ricavato sulle caratteristiche farmacologiche di ciascun farmaco e il recettore a cui si lega 3-5. Esperimenti di questo tipo Garner anche informazioni sulla concorrenza contro natura non competitiva degli antagonisti utilizzati, nonché eterogeneità recettore e effetti non specifici farmacologiche 6-8. Così, con permutazioni semplici a questa isolata esperimento vasca tessuto, un profilo farmacologico relativamente completo dei recettori che mediano agonista indotta contrazione muscolare può essere generato.
In termini di agonismo, the efficacia relativa (E MAX) e la potenza (EC 50) di un agonista in un dato tessuto possono essere calcolati e rispetto alle reazioni di altri agonisti della stessa tessuti 1. Nel nostro esperimento, il ratto dell'aorta toracica è stata incubata con entrambi veicolo o α 1 antagonista del recettore adrenergico prazosin (5 nM) per una ora prima di aggiungere l'α 1 adrenergico fenilefrina al bagno tessuti e generando contrazione. Figura 2 presenta modificato risultati di figura 1. Le risposte verdi sono stati contrassegnati con la contrazione massima raggiunta dal PE contrassegnati come max, la ½ massima contrazione contrassegnati come tali e poi associato alla concentrazione di PE che ha causato tale risposta. Identificare questi valori è identificare la concentrazione effettiva di un agonista che realizza un mezzo max (50%) di risposta o valore EC 50.
Purtroppo, con il parametro agonista-dipendentes da solo per determinare le caratteristiche dei recettori di legame può essere complicato 9. Idealmente, ulteriori esperimenti utilizzando antagonisti dei recettori permettono il calcolo dei due parametri importanti che sono fondamentali per definire l'interazione tra un farmaco e un recettore: la -log 10 della dissociazione antagonista costante (pK B) e la -log 10 dell'antagonista molare concentrazione necessaria per suscitare duplice spostamento verso destra della curva concentrazione-risposta (pA 2) 10. Sia K B e pA 2 guadagno loro utilità dal fatto che esse sono valori agonisti indipendenti, e rimangono costanti anche tra differenti tessuti 11. Dai dati della figura 2, pK B può essere calcolata utilizzando la seguente equazione e basato su valori di EC 50 calcolati altrove:
CE 50 in assenza di prazosin = 2 x 10 -8 M
CE 50 nella presence di prazosina = 7 x 10 -6 M
Risolvere per K B nella seguente equazione:
log (dr-1) = log [B] – log K B
Dove:
[B] = concentrazione antagonista, o 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8.3
dr = rapporto dose di valore EC 50 in presenza di antagonisti / CE 50 in assenza. Se vi è uno spostamento verso destra, questo valore sarà maggiore di uno. Pertanto:
dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M o 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
Sostituendo per [B] e dr:
log (350-1) = -8 – log K B
2.54 = -8 – log KB
pK B = 10.54
Questo valore per prazosina è coerente con i valori ottenuti quando prazosina interagisce con un α 1 adrenergici recepto 12,13, suggerendo che il recettore adrenergico mediare contrazione fenilefrina è il recettore adrenergico α 1.
Diversi passi sono fondamentali per il successo di questi esperimenti. I tessuti devono rimanere in PSS dopo la dissezione per prevenire la perdita di vitalità del tessuto. Qualsiasi preparazione muscolare isometrica ha un ottimo rapporto lunghezza-tensione che genera forza massima contro tensione passiva 14,15. Per l'esperimento descritto in questo protocollo, tensione passiva ottimale è stato precedentemente determinato da incrementi brevemente aggiunta di 0,5 g di tensione passiva al tessuto. Il tessuto deve iniziare senza tono e poi, dopo 30 minuti di equilibrio, il tessuto è stato sfidato con una concentrazione massima di KCl (80 mm), che ha generato tono attivo. Quindi, il tessuto è stato lavato e lasciata tornare a tono basale. Dopo 15 min al basale, un'altra 0,5 g di tensione passiva è stata posta e questo processo ripetuto finché un plateau ditensione attiva è stato raggiunto con tensione passiva supplementare. In esperimenti preliminari, 4 g totale di tensione passiva è stato determinato per raggiungere la massima generazione tensione attiva in anelli aortici, e quindi tale quantità totale di tensione è posto sugli anelli prima equilibrazione. Procedurale, è meglio azzerare prima applicazione tensione passiva, ma può essere fatto in qualsiasi momento prima dell'esperimento. Over-stiramento dei tessuti, in qualsiasi punto l'esperimento o dissezione, avrà un impatto negativo vitalità del tessuto e dei risultati sperimentali. Questo è più indispensabile quando si posiziona tessuti nel bagno, in quanto questa operazione ha la più alta probabilità di eccessivo stiramento. Lavaggio adeguato, in numero e durata è richiesto per gli effetti riproducibili. Una seconda sfida troppo presto dopo una sfida iniziale, o prima di tessuti sono tornati alla tensione di riferimento, si tradurrà in risposte aberranti. Se lo studio reversibili antagonisti / inibitori, i tessuti non devono essere lavati prima di agonista Inoltre, come l'inibizioneconcentrazione tor sarà diminuito.
Ci sono notevoli vantaggi e svantaggi per gli isolati da bagno tessuto saggi.
Svantaggi: I tessuti possono sperimentare diversi gradi di danni durante la rimozione chirurgica o il posizionamento di anelli a ganci. Poiché la cellula endoteliale è il rivestimento interno dell'anello aortico, è necessario prestare attenzione al posizionamento dell'anello a ganci in modo da non danneggiare questo strato di cellule. I tessuti possono anche avere distintamente differenti lunghezze di tempo in cui sono vitali nel bagno tessuti, e questo deve essere determinata; Non tutti i tessuti sono uguali. Lungo queste linee, i tessuti possono cambiare nella loro capacità di risposta per tutto il giorno in modo che i controlli orari diventano un controllo necessario per ogni esperimento. Un buon esempio di questo è la trachea cavia che migliora in contrattilità massimo del 100% durante un tipico esperimento 8 ore. I farmaci che sono poco solubili in acqua possono precipitare nel PSS. Infine, un cumulativoND additivi non cumulativi di un farmaco che è un agonista potrebbe tradursi in risultati diversi se si verifica recettore desensibilizzazione per l'agonista; angiotensina II è uno di questi farmaci che mostra tachifilassi rapidi.
Vantaggi: Uno dei vantaggi principali di tessuto esperimenti bagno è che è in tempo reale; si può vedere l'esperimento come si svolge e può rapidamente trarre conclusioni e pianificare i prossimi passi, così come risoluzione dei problemi durante un esperimento. Un esperimento prende un giorno di fare. Tessuti multipli possono tipicamente essere preparati da un animale in modo che un animale può servire come proprio controllo, e che aggiunge forza per un esperimento. Uno può anche isolare il tessuto da altri fattori, per testare una risposta relativamente pura del tessuto al farmaco. In esperimenti in vitro come il sistema vasca tessuto permettono anche l'uso di una piccola quantità di farmaco rispetto ad un esperimento in vivo.
Il disegno sperimentale di base qui descritto può essereampiamente modificato per consentire la registrazione dei parametri aggiuntivi o l'introduzione di altri stimoli esterni. Ad esempio, l'aggiunta di elettrodi consente campo stimolazione elettrica di nervi che innervano 16,17. Con l'aggiunta di sonde termiche o di pH, gli effetti della temperatura e del pH sulle risposte contrattili possono essere misurati 18,19. Analogamente, l'ossigeno può essere sostituito parzialmente o completamente con N 2 per valutare ipossia effetti indotti. Inoltre, gli stessi principi di base della misurazione contrattilità isometrica utilizzati in questo video possono essere utilizzati per sviluppare sistemi che permettono la misurazione concomitante di sviluppo tensione isometrica e cambiamenti di calcio intracellulare 20. La trasduzione del segnale è anche facilmente studiato, poiché esistono sistemi che possono rapidamente congelare un campione di tessuto durante una risposta, in modo tale che l'attività di un sistema via di trasduzione del segnale può essere verificata biochimicamente.
La variazione di equipment che può essere usato per fare questo è enorme. L'intero sistema, sia a mano costruito o automatico, può essere acquistato da più aziende diverse. I bagni di tessuto e titolari dei tessuti utilizzati in questo protocollo sono stati (bagni tissutali) e costruito a mano (titolari) soffiato a mano da parte di un in-house officine Michigan State University.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| LabChart Software | ADInstruments | 7.2 | |
| PowerLab (4 channel) | ADInstruments | ML760 | |
| QuadBridge (4 channel) | ADInstruments | ML112 | ML112 |
| Grass Adapter Cable | ADInstruments | MLAC11 | MLAC11 |
| Grass Force-Displacement Transducer | Grass Instrument Co | FT03 | FT03 |
| Grass Transducer Cable | Grass Instrument Co | TAC-7 REV-1 | |
| BNC to BNC Cable | ADInstruments | MLAC01 | |
| IsoTemp 2100 | Fisher Scientific | IC-2100 | |
| Tissue Bath | Multiple Sources | ||
| Physiological Salt Solution | PSS | ||
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Ring Stand | Humboldt MFG Co | H-2122 7 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Tygon Tubing | VWR Scientific | 63010-100 | R-3603 |
| Hose Clamps | Cole-Parmer Instrument Co | 06832-08 | SNP-8 |
| 50ml Muscle Bath | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| 250ml Warming Chambers | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| Gas Dispersion Tube | Ace Glass | 7202-06 | 7202-02 |
| Micrometer | |||
| Custom Stands | |||
| Three-Prong Clamps | VWR International | Talon | |
| S-Connector | VWR International | Talon | |
| Tissue Hooks | Hand Made in House | Custom | |
| Tissue Dissection | |||
| Leica Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | 12562-36 |
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | 160-150 |
| Splinter & Fixation Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | 160-55 |
References
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