قياس السلس وظيفة العضلات في الأنسجة المعزولة حمام تطبيقات لأبحاث الصيدلة
Summary
This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.
Abstract
Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum – if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.
Introduction
انضباط الصيدلة استخدمت نظام حمام الأنسجة المعزولة لأكثر من 150 عاما. وقد سمح براعة هذا النظام العلماء في جميع أنحاء العالم لتوصيف مستقبلات وإشارة المستقبلة التنبيغ، مع هذه المعرفة التي تشكل أساس العلاجات التي تعامل الملايين من الأفراد الذين يعانون من أمراض أو اضطرابات مثل ارتفاع ضغط الدم وفشل القلب، والسكري، وأمراض الجهاز الهضمي والمثانة اختلال وظيفي، والربو، واضطرابات البلع، على سبيل المثال لا الحصر. حتى يومنا هذا، لا يزال حمام الأنسجة المعزولة جانبا مهما من تطوير الأدوية والبحوث الأساسية، لأنها تسمح الأنسجة لتكون بمثابة الأنسجة. في هذا الدرس إن الرب، وتتقاسم بروتوكول رسمي لإثبات تجربة بصرية والافتراضية باستخدام بيانات من الأنسجة التجربة حمام معزولة الذي يقيس تقلص متساوي القياس، الذي يسمح توصيف مستقبلات.
والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أن الأنسجة يعيش فيوظائف ND بمثابة النسيج كله، مع النتيجة الفسيولوجية (تقلص أو الاسترخاء) التي هي ذات الصلة إلى الجسم. ومن توليفة من الخطوات (المخدرات التفاعل مستقبلات، نقل الإشارة، وتوليد رسول الثاني، وتغير في استثارة العضلات الملساء، والتغيير في وظيفة الأنسجة). في حين غيرها من التقنيات تسمح دراسة كل من هذه الخطوات (على سبيل المثال جين مشع ملزمة للتقارب المخدرات، وقياس رسل الثانية)، وتقنية معزولة حمام الأنسجة تسمح لدمج كل هذه الخطوات من 1. ميزة أخرى هي أن الإبقاء على وظيفة الأنسجة يسمح حساب المتغيرات الدوائية المهمة التي هي أكثر وضوحا في نسيج مقابل إعداد الخلوي. يتعلق الأمر أقرب إلى كيفية فحص المخدرات ستعمل في الجسم ككل.
Protocol
Representative Results
Discussion
قياس قوة متساوي القياس كأداة بحث أكثر من 150 سنة، لكنه لا يزال تقنية نموذجية لتوصيف مستقبلات في أنسجة مقلص 2. قوة هذه التقنية هي في بساطتها والتنوع: من خلال تسجيل الاستجابات التي تسببها زيادة تركيزات ناهض في وجود أو عدم وجود خصم، عدد لا يحصى من المعلومات يمكن أن تستمد حول الخصائص الدوائية من كل دواء ومستقبلات التي فإنه يلزم 3-5. تجارب من هذا النوع أيضا جمع معلومات حول تنافسية مقابل الطبيعة غير التنافسية للمضادات المستخدمة، وكذلك مستقبلات عدم التجانس والآثار غير محددة المخدرات 6-8. وهكذا، مع التباديل بسيطة لهذه التجربة حمام الأنسجة المعزولة، يمكن أن تتولد لمحة الدوائية كاملة نسبيا من المستقبلات التي تتوسط تقلص العضلات الناجم عن ناهض.
من حيث التحولي، الالبريد الكفاءة النسبية (E MAX) وقوة (EC 50) من ناهض في نسيج معين ويمكن حساب ومقارنة ردود منبهات أخرى في نفس الأنسجة 1. في تجربتنا، وحضنت الفئران الأبهر الصدري مع أي مركبة أو α 1 الأدرينالية مستقبلات برازوسين (5 نانومتر) لساعة واحدة قبل إضافة α 1 الأدرينالية ناهض فينيليفرين إلى الحمام الأنسجة وتوليد تقلص الشكل 2 يعرض تعديل النتائج في الشكل 1. وقد تم وضع علامة على الردود الخضراء مع الحد الأقصى للانكماش كتبها PE حققت علامة ماكس، وضع علامة الحد الأقصى للانكماش ½ على هذا النحو ثم يرتبط مع تركيز PE التي تسببت في هذا الرد. تحديد هذه القيم هو تحديد تركيز الفعال لناهض الذي يحقق نصف كحد أقصى (50٪) استجابة أو EC 50 قيمة.
لسوء الحظ، وذلك باستخدام المعلمة التي تعتمد على ناهضليالي وحده لتحديد الخصائص ملزمة مستقبلات يمكن أن يكون معقدا 9. من الناحية المثالية، تجارب إضافية باستخدام مضادات مستقبلات تسمح حساب اثنين من المعالم الهامة التي هي المفتاح لتحديد التفاعل بين المخدرات والمستقبلة: و-log 10 من التفكك خصم ثابت (PK B) و-log 10 من خصم المولي التركيز الضروري يثير شقين التحول نحو اليمين في منحنى التركيز والاستجابة (PA 2) 10. كلا K B والسلطة الفلسطينية 2 مكاسب فائدتها من حقيقة أنها هي القيم ناهض مستقل، وتظل ثابتة حتى بين الأنسجة المختلفة 11. من البيانات في الشكل 2، ويمكن حساب PK B باستخدام المعادلة التالية وعلى أساس EC 50 القيم المحسوبة في أي مكان آخر:
EC 50 في غياب برازوسين = 2 × 10 -8 M
EC 50 في مرحلة ما قبلالعمالي من برازوسين = 7 × 10 -6 M
حل لK B في المعادلة التالية:
تسجيل (DR-1) = تسجيل الدخول [B] – تسجيل K B
أين:
[B] = تركيز خصم، أو 5 × 10 -9 م. تسجيل (5 × 10 -9 M) = -8.3
الدكتور = نسبة جرعة من EC 50 قيمة في وجود خصم / EC 50 في الغياب. إذا كان هناك تحولا نحو اليمين، وهذه القيمة تكون أكبر من واحد. على النحو التالي:
الدكتور = 7 × 10 -6 M / 2 × 10 -8 M أو 700 × 10 -8 M / 2 × 10 -8 M = 700/2 = 350
استبدال ل[B] والدكتور:
تسجيل (350-1) = -8 – تسجيل K B
2.54 = -8 – تسجيل KB
PK B = 10.54
هذه القيمة لبرازوسين تتفق مع القيم التي تم الحصول عليها عندما يتفاعل برازوسين مع α 1 الأدرينالية باستقبالأو 12،13، مما يدل على أن مستقبلات هرمون التوتر التوسط تقلص إلى فينيليفرين هو الأدرينالية مستقبلات α 1.
عدة خطوات حاسمة لنجاح هذه التجارب. يجب أن تبقى الأنسجة في PSS بعد تشريح لمنع فقدان الجدوى الأنسجة. أي تحضير العضلات متساوي القياس لديه علاقة طول التوتر الأمثل الذي يولد قوة قصوى ضد التوتر السلبي 14،15. للتجربة وصفها في هذا البروتوكول، تقرر التوتر السلبي الأمثل سابقا بزيادات مضيفا فترة وجيزة من 0.5 غرام من التوتر السلبي إلى الأنسجة. وينبغي أن تبدأ الأنسجة دون لهجة وثم بعد 30 دقيقة من موازنة، وطعن في الأنسجة مع التركيز القصوى من بوكل (80 ملم)، التي ولدت لهجة نشطة. ثم، وجرفت الأنسجة ويسمح لهم بالعودة إلى لهجة خط الأساس. بعد 15 دقيقة في الأساس، وضعت 0.5 غرام آخر من التوتر السلبي وتتكرر هذه العملية حتى هضبة منوقد تحقق التوتر النشط مع التوتر السلبي إضافية. في التجارب الأولية، تم تحديد 4 ز مجموعه التوتر السلبي لتحقيق جيل التوتر نشط القصوى في حلقات الأبهري، وبالتالي يتم وضع هذا المبلغ الإجمالي للتوتر على الحلقات قبل موازنة. من الناحية الإجرائية، فمن الأفضل أن الصفر تطبيق التوتر السلبي مسبق، ولكن يمكن القيام به في أي وقت قبل التجربة. الإفراط في التمدد الأنسجة، وعند أي نقطة في التجربة أو التشريح، وسوف تؤثر سلبا على قابلية الأنسجة والنتائج التجريبية. هذا هو الأكثر الضروري عند وضع الأنسجة في الحمام، وهذه الخطوة لديها أعلى احتمال امتداد المفرط. مطلوب غسل الكافي، في عدد ومدة للآثار استنساخه. التحدي الثاني قريبا جدا بعد التحدي الأولي، أو قبل عادوا إلى الأنسجة التوتر خط الأساس، سوف يؤدي إلى استجابات الشاذة. إذا دراسة الخصوم عكسها / مثبطات، لا يجب غسل الأنسجة قبل ناهض بالإضافة إلى ذلك، كما inhibiسيتم انخفض تركيز تور.
هناك مزايا وعيوب ملحوظة إلى المعزولة المقايسات حمام الأنسجة.
العيوب: الأنسجة قد تواجه درجات مختلفة من الضرر أثناء الاستئصال الجراحي أو وضع حلقات على السنانير. منذ الخلية البطانية هي البطانة الداخلية للحلقة الأبهر، يجب الحرص على وضع الطوق على السنانير حتى لا تتلف هذه الطبقة الخلية. قد يكون الأنسجة أيضا أطوال مختلفة بوضوح من الوقت في التي هي قابلة للحياة في الحمام الأنسجة، وهذا لابد من تحديدها. ليس كل الأنسجة هي نفسها. على طول هذه الخطوط، قد تتغير الأنسجة في استجابتها طوال اليوم مثل أن الضوابط الوقت تصبح السيطرة اللازمة لكل تجربة. وخير مثال على ذلك هو القصبة الهوائية خنزير غينيا الذي يحسن في انقباض أقصى بنسبة 100٪ خلال التجربة 8 ساعة نموذجية. الأدوية التي هي سيئة للذوبان في الماء قد تترسب في PSS. أخيرا، وهو التراكميالثانية الإضافات غير تراكمية من المخدرات التي هي ناهض يمكن أن يؤدي إلى نتائج مختلفة إذا حدثت مستقبلات الحساسية إلى ناهض. أنجيوتنسين II هو واحدة من هذه المخدرات مما يدل tachyphylaxis السريعة.
المزايا: واحدة من المزايا الأساسية من الأنسجة التجارب حمام هو أنه في الوقت الحقيقي. يمكن للمرء أن يرى التجربة فور وقوعها ويمكن أن تجعل بسرعة الاستنتاجات وتخطيط الخطوات المقبلة، فضلا عن استكشاف أخطاء أثناء التجربة. تجربة يأخذ يوميا للقيام به. يمكن عادة أنسجة متعددة تكون مستعدة من حيوان واحد بحيث حيوان يمكن أن تكون بمثابة السيطرة الخاصة بها، والتي تضيف قوة إلى التجربة. واحد يمكن عزل الأنسجة من العوامل الأخرى وذلك لاختبار استجابة نقية نسبيا من الأنسجة إلى المخدرات. وفي التجارب المختبرية مثل نظام حمام الأنسجة تسمح أيضا استخدام كمية صغيرة من المخدرات مقارنة تجربة في الجسم الحي.
التصميم التجريبي الأساسي الموصوفة هنا يمكن أن يكونتعديل على نطاق واسع للسماح لتسجيل معلمات إضافية أو إدخال مؤثرات الخارجية الأخرى. على سبيل المثال، إضافة أقطاب تسمح لتحفيز الحقل الكهربائي للأعصاب التعصيب 16،17. مع إضافة تحقيقات الحرارية أو درجة الحموضة، وآثار درجة الحرارة ودرجة الحموضة على ردود مقلص ويمكن أيضا أن تقاس 18،19. وبالمثل، والأكسجين يمكن أن تكون بديلا جزئيا أو كليا مع N 2 لتقييم الآثار التي يسببها نقص الأكسجة. وعلاوة على ذلك، وهي نفس المبادئ الأساسية لقياس انقباض متساوي القياس المستخدمة في هذا الفيديو يمكن استخدامها لتطوير الأنظمة التي تسمح بقياس ما يصاحب ذلك من تطور التوتر متساوي القياس والتغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا 20. كما يتم دراسة نقل الإشارة بسهولة، لأن وجود الأنظمة التي يمكن تجميد بسرعة عينة الأنسجة خلال ردا على ذلك، مثل أن النشاط من التنبيغ نظام المسار إشارة يمكن التحقق كيميائيا.
تباين من الأجهزةipment التي يمكن استخدامها للقيام بذلك هو هائل. هذا النظام برمته، إما ناحية بناؤها أو الآلي، ويمكن شراؤها من شركات مختلفة متعددة. وكانت الحمامات الأنسجة وأصحاب الأنسجة المستخدمة في هذا البروتوكول اليد في مهب (حمامات الأنسجة) واليد التي شيدت (حامل اللقب) من قبل في المنزل جامعة ولاية ميشيغان المحلات التجارية آلة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| LabChart Software | ADInstruments | 7.2 | |
| PowerLab (4 channel) | ADInstruments | ML760 | |
| QuadBridge (4 channel) | ADInstruments | ML112 | ML112 |
| Grass Adapter Cable | ADInstruments | MLAC11 | MLAC11 |
| Grass Force-Displacement Transducer | Grass Instrument Co | FT03 | FT03 |
| Grass Transducer Cable | Grass Instrument Co | TAC-7 REV-1 | |
| BNC to BNC Cable | ADInstruments | MLAC01 | |
| IsoTemp 2100 | Fisher Scientific | IC-2100 | |
| Tissue Bath | Multiple Sources | ||
| Physiological Salt Solution | PSS | ||
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Ring Stand | Humboldt MFG Co | H-2122 7 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Tygon Tubing | VWR Scientific | 63010-100 | R-3603 |
| Hose Clamps | Cole-Parmer Instrument Co | 06832-08 | SNP-8 |
| 50ml Muscle Bath | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| 250ml Warming Chambers | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| Gas Dispersion Tube | Ace Glass | 7202-06 | 7202-02 |
| Micrometer | |||
| Custom Stands | |||
| Three-Prong Clamps | VWR International | Talon | |
| S-Connector | VWR International | Talon | |
| Tissue Hooks | Hand Made in House | Custom | |
| Tissue Dissection | |||
| Leica Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | 12562-36 |
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | 160-150 |
| Splinter & Fixation Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | 160-55 |
References
- Kenakin, T. P. The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues. Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).
- Scheindlin, S. A brief history of modern pharmacology. Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).
- Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy. Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).
- Arunlakshana, O., Schild, H. O. Some quantitative uses of drug antagonists. Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).
- Christopoulos, A., Kenakin, T. G. protein-coupled receptor allosterism and complexing. Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).
- Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility. Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).
- Singh, J., et al. Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).
- Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression. J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).
- Colquhoun, D. Agonist-activated ion channels. Br. J. Pharmacol. 147, S17-26 (2006).
- Wyllie, D. J., Chen, P. E. Taking the time to study competitive antagonism. Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).
- Schild, H. O. pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947. Br. J. Pharmacol. 120 (4), 29-46 (1997).
- Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta. Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).
- Hiraoka, Y., et al. Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate. Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).
- Cooke, P. H., Fay, F. S. Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle. J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).
- Davis, M. J., Gore, R. W. Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles. Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).
- Davis, R. P., et al. One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat. ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).
- Heppner, T. J., et al. Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).
- Burdyga, T. V., Wray, S. On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle. J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).
- Hyvelin, J. M., O’Connor, C., McLoughlin, P. Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).
- Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava. Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).
