Farmakoloji Araştırma İzole Doku Banyo-uygulamalarda Düz Kas Fonksiyon Ölçümü
Summary
This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.
Abstract
Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum – if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.
Introduction
farmakoloji disiplini, 150 yılı aşkın bir süredir izole organ banyosu sistemi kullandı. Bu sistemin çok yönlülüğü hipertansiyon, kalp yetmezliği, diyabet, gastrointestinal hastalık, mesane gibi hastalıklar ya da bozuklukları olan bireylerin milyonlarca tedavi etmiş tedavilerin temelini oluşturan bu bilgi ile, reseptörleri ve reseptör sinyal iletimini karakterize dünya çapında bilim adamları izin verdi disfonksiyon, astım ve yutma bozuklukları, sadece birkaç isim. Doku, bir doku olarak işlev sağlar gibi bu gün için, izole organ banyosu, ilaç geliştirme ve temel araştırma önemli bir yüzünü kalır. Bu vallahi derste, resmi protokol reseptör karakterizasyonu izin izometrik daralma ölçen bir izole organ banyosu deney, veri kullanan bir görsel ve sanal deney göstermek için paylaşılır.
Bu tekniğin en önemli avantajı, doku yaşayan olmasıdırvücuda alakalı bir fizyolojik sonuç (kasılma veya gevşeme) ile bir bütün dokusu gibi nd fonksiyonlar. Bu adımlar (ilaç-reseptör etkileşimi, sinyal iletimi, ikinci haberci nesil, düz kas uyarılabilirliğindeki değişim ve doku fonksiyonunda değişiklik) bir sentezidir. Diğer teknikler bu adımların her birinin çalışma (örneğin radyo-ilaç afinite, ikinci haberciler ölçümü için bağlayıcı) izin verirken, izole organ banyosu tekniği tüm bu adımların 1 entegrasyonu sağlar. Diğer bir avantajı doku işlevini koruyarak hücresel ortamda vs dokuda daha anlamlı olan önemli farmakolojik değişkenlerin hesaplanmasına imkan olduğunu; incelenen ilaçların bir bütün olarak vücutta nasıl çalışacağını yakın geliyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir araştırma aracı olarak izometrik kuvvet ölçümü 150 yaşında, ama kasılma dokularda 2 reseptör karakterizasyonu için prototip tekniği olmaya devam ediyor. Bu tekniğin güç basitliği ve çok yönlülük olup: bir antagonistin varlığında veya yokluğunda, bir agonist arasında artan konsantrasyonları ile tetiklenen tepkileri kaydederek bir bilgi sayısız her ilacın farmakolojik özellikleri ve reseptör ile ilgili elde edilebildiği o 3-5 bağlar. Bu tür deneyler ayrıca, kullanılan antagonistler rekabetçi olmayan doğaya karşı rekabet ilgili bilgilerin yanı sıra reseptör heterojenliği ve spesifik olmayan ilaç etkileri 6-8 toplamak. Bu nedenle, bu izole edilmiş bir organ banyosu deney basit permütasyon ile, agonist kaynaklı kas büzülmesine neden reseptörlerinin nispeten tam farmakolojik profili elde edilebilir.
Agonizmi açısından, inciBelirli bir doku, bir agonist e nispi etkinlik (Emax) ve güçte (EC50), aynı doku 1 diğer agonistlerin yanıtlarına göre hesaplanır ve edilebilir. Bizim deneyde, sıçan aort araç ya da önceden daralma doku banyosuna α 1 adrenerjik agonisti fenilefrin ilave edilmesi ve üretilmesi için bir saat α 1 adrenerjik reseptör antagonisti, prazosin (5 nM) ya da birlikte inkübe edildi. Modifiye sonuçları 2 sunar Şekil Yeşil tepkiler max olarak işaretlenmiş PE tarafından elde edilen maksimum kasılma ile işaretlenmiş Şekil 1., ½ maksimum kasılma gibi işaretlenir ve daha sonra cevap olduğunu neden olduğu PE konsantrasyonu ile ilişkili. Bu değerler belirlenmesi yarım maksimum (% 50) tepki ya da EC50 değeri elde eden bir agonistinin etkili konsantrasyonu tespitidir.
Ne yazık ki, agonist bağımlı parametre kullanılarakreseptör bağlanma özellikleri 9 karmaşık olabilir belirlemek için tek başına s. Sabit antagonisti ayrışma (pKa B) log 10 mol antagonist -log 10: İdeal olarak, reseptör antagonistleri kullanarak ek deneyler, bir ilacın ve bir reseptörü arasındaki etkileşimin tanımlanması için önemli olan iki önemli parametrelerin hesaplanmasına imkan gerekli konsantrasyonu, konsantrasyon-yanıt eğrisinde iki kat sağa doğru bir kaymaya (pA2) 10 çıkarmak için. K B ve pA 2 kazanç onlar agonist-bağımsız değerlerdir ve hatta farklı dokular 11 arasında sabit kalması aslında onların kullanışlılığı Hem. Başka hesaplanmaktadır 50 değerleri Şekil 2 'de verilerden pKa B, aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanabilir ve EC'ye göre:
= 2 x 10 8 M prazosin yokluğunda EC50
Öncesi AK 50prazosin sence = 7 x 10 -6 M
Aşağıdaki denklemde K B çözün:
log (dr-1) = [B] log – K B log
Nerede:
[B] antagonisti konsantrasyonunu = veya 5 x 10 -9 M log (5 x 10 -9 M) = -8.3
dr = yokluğunda antagonist / EC 50 varlığında AT 50 değer doz oranı. Sağa doğru bir kayma ise, bu değer, birden daha fazla olacaktır. Böylece:
dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M veya 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
[B] ve dr için yerine:
K B log – = -8 (350-1) log
2.54 = -8 – KB log
pKa B = 10.54
Prazosinin bir α 1 adrenerjik recept ile etkileşime girdiğinde prazosin Bu değer, elde değerlerle tutarlıfenilefrinle daralma aracılık adrenerjik reseptör α 1 adrenerjik reseptör olduğunu düşündüren ya da 12,13,.
Birkaç adım bu deneylerin başarısı için kritik öneme sahiptir. Dokular, doku yaşabilirliği kaybını önlemek için ayrıldıktan sonra, PSS kalmalıdır. Herhangi bir izometrik kas hazırlık pasif gerginlik 14,15 karşı maksimum güç üretir optimal uzunluk-gerilim ilişkisi vardır. Bu protokolde tarif edilen deneme için, en iyi pasif gerilim önceden dokuya pasif gerilim 0.5 g kısa bir süre ilave artışlarla saptanmıştır. Doku tonu olmadan başlamalı ve dengeleme için 30 dakika sonra, doku aktif sesi üretilir KCI (80 mM) bir maksimum konsantrasyonu ile meydan. Daha sonra, doku yıkandı ve bazal tonu geri bırakıldı. Başlangıçta 15 dakika sonra pasif geriliminin bir diğer 0.5 gr yerleştirilmiş ve bu işlem, bir plato kadar tekrarlanırAktif gerginlik ek pasif gerilim ile elde edilmiştir. Hazırlık deneylerinde, pasif gerginlik 4 g aort halkalarında maksimal etkin gerilim yaratma amaçlı belirlendi ve böylece gerilim bu toplam miktarı önce dengeleme için çalma üzerine yerleştirilir. Prosedürel, önceden pasif germe uygulaması sıfıra en iyi, ama deney öncesinde herhangi bir zamanda yapılabilir. Deney ya da diseksiyon herhangi bir noktada, dokuları germe Aşırı olumsuz doku canlılığını ve deneysel sonuçlar etkileyecektir. Bu adım, aşırı streç en yüksek olasılığı olduğu gibi, banyoda dokuları yerleştirirken Bu en zorunludur. Sayısı ve süresi yeterli yıkama, yeniden üretilebilir etkileri için gereklidir. İkinci zorluk çok yakında dokular başlangıç gerilim döndü ilk mücadeleden sonra, ya da önce, anormal tepkiler neden olacaktır. Döner antagonistleri / inhibitörleri araştırıldığında ise, dokular inhibi olarak, ilave Agonisti önce yıkanmamalıdırtor konsantrasyonu azalacaktır.
Izole organ banyosu deneyleri için önemli avantaj ve dezavantajları vardır.
Dezavantajları: Dokular kanca halkaları cerrahi olarak çıkarılması veya yerleştirilmesi sırasında hasar farklı derecelerde karşılaşabilirsiniz. Endotel hücre aort halkasının iç astar olduğu bu hücre tabakasına zarar vermemek için, bakım kanca halka yerleşiminde alınmalıdır. Dokular ayrıca, doku banyosu içindeki uygun olduğu zaman belirgin bir biçimde farklı uzunluklara sahip olabilir, ve bu tespit eder; tüm dokular aynıdır. Bu doğrultuda, dokular zaman kontrolleri, her deney için gerekli kontrol olmak gibi o gün boyunca yanıt değişebilir. Bu iyi bir örnek tipik bir 8 saat deney sırasında% 100 kontraktilite maksimum geliştirir kobay trakea olduğunu. Suda zayıf ölçüde çözünür olan ilaçlar PSS çökelebilir. Son olarak, toplu birnd agonist reseptör duyarsızlaştırma oluşursa bir agonist, farklı sonuçlara neden olabilir olan bir ilacın kümülatif olmayan ilaveler; anjiotensin II hızlı Taşiflaksi gösterir böyle bir ilaçtır.
Avantajları: Doku banyo deneylerinin temel avantajlarından biri gerçek zamanlı olmasıdır; o yaşanıyor ve hızla sonuç yapmak ve bir deney sırasında sonraki adımlar, yanı sıra gidermenize planı gibi bir deney görebilirsiniz. Bir deney yapmak için bir gün sürer. Multipl dokular tipik haliyle, bir hayvan, kendi kontrolü olarak görev yapabilir, öyle ki, bir hayvandan elde edilebilir ve bu, bir deney gücü ekler. Ilacın doku nispeten saf karşılığının test edilmesi için, böylece bir diğer faktörlere doku izole edilebilir. Bu tür bir doku banyosu sistemi in vitro deneyler, aynı zamanda bir in vivo deney göre ilacın küçük bir miktarının kullanılmasını sağlar.
Burada tarif edilen temel deneysel tasarım olabiliryaygın olarak ilave parametrelerin kaydedilmesi ya da diğer dış uyaranların giriş sağlamak için değiştirilebilir. Örneğin, elektrot eklenmesi innerve sinir 16,17 elektrik alan uyarımı için izin verir. Termal veya pH sondaları eklenmesiyle, kasılmaları üzerindeki sıcaklık ve pH etkileri de 18,19 ölçülebilir. Benzer bir şekilde, oksijen, kısmen veya hipoksi nedenli etkilerini değerlendirmek için N2 ile tam olarak sübstitüe edilmiş olabilir. Bundan başka, bu video kullanılan izometrik kontraktilite ölçüm aynı temel prensiplerin hücre içi kalsiyum 20 izometrik gerilim gelişim ve değişikliklerin eşlik eden ölçümüne olanak sistemleri geliştirmek için de kullanılabilir. Sistemleri, bu hızla yanıt sırasında bir doku örneği dondurarak bulunduğu için sinyal transdüksiyonu, hali hazırda, incelenen, bir sinyal iletim yolu sisteminin aktivitesi biyokimyasal kontrol edilebilir, öyle ki.
eşdeğeri varyasyonBunu yapmak için de kullanılabilir ipment çok büyüktür. Bütün bu sistem, inşa veya otomatik iki el, birden fazla farklı şirketlerden satın alınabilir. Bu protokolde kullanılan doku banyoları ve doku sahipleri in-house Michigan State Üniversitesi Makine mağazaları tarafından el üfleme (doku banyoları) ve el inşa (sahipleri) idi.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| LabChart Software | ADInstruments | 7.2 | |
| PowerLab (4 channel) | ADInstruments | ML760 | |
| QuadBridge (4 channel) | ADInstruments | ML112 | ML112 |
| Grass Adapter Cable | ADInstruments | MLAC11 | MLAC11 |
| Grass Force-Displacement Transducer | Grass Instrument Co | FT03 | FT03 |
| Grass Transducer Cable | Grass Instrument Co | TAC-7 REV-1 | |
| BNC to BNC Cable | ADInstruments | MLAC01 | |
| IsoTemp 2100 | Fisher Scientific | IC-2100 | |
| Tissue Bath | Multiple Sources | ||
| Physiological Salt Solution | PSS | ||
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Ring Stand | Humboldt MFG Co | H-2122 7 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Tygon Tubing | VWR Scientific | 63010-100 | R-3603 |
| Hose Clamps | Cole-Parmer Instrument Co | 06832-08 | SNP-8 |
| 50ml Muscle Bath | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| 250ml Warming Chambers | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| Gas Dispersion Tube | Ace Glass | 7202-06 | 7202-02 |
| Micrometer | |||
| Custom Stands | |||
| Three-Prong Clamps | VWR International | Talon | |
| S-Connector | VWR International | Talon | |
| Tissue Hooks | Hand Made in House | Custom | |
| Tissue Dissection | |||
| Leica Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | 12562-36 |
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | 160-150 |
| Splinter & Fixation Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | 160-55 |
References
- Kenakin, T. P. The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues. Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).
- Scheindlin, S. A brief history of modern pharmacology. Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).
- Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy. Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).
- Arunlakshana, O., Schild, H. O. Some quantitative uses of drug antagonists. Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).
- Christopoulos, A., Kenakin, T. G. protein-coupled receptor allosterism and complexing. Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).
- Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility. Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).
- Singh, J., et al. Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).
- Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression. J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).
- Colquhoun, D. Agonist-activated ion channels. Br. J. Pharmacol. 147, S17-26 (2006).
- Wyllie, D. J., Chen, P. E. Taking the time to study competitive antagonism. Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).
- Schild, H. O. pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947. Br. J. Pharmacol. 120 (4), 29-46 (1997).
- Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta. Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).
- Hiraoka, Y., et al. Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate. Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).
- Cooke, P. H., Fay, F. S. Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle. J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).
- Davis, M. J., Gore, R. W. Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles. Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).
- Davis, R. P., et al. One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat. ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).
- Heppner, T. J., et al. Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).
- Burdyga, T. V., Wray, S. On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle. J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).
- Hyvelin, J. M., O’Connor, C., McLoughlin, P. Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).
- Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava. Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).
