Mesure de la fonction musculaire lisse dans les tissus isolés Bath-applications à la pharmacologie de recherche
Summary
This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.
Abstract
Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum – if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.
Introduction
La discipline de la pharmacologie a utilisé le système de bain de tissu isolé depuis plus de 150 ans. La polyvalence de ce système a permis aux scientifiques à travers le monde pour caractériser les récepteurs et signal du récepteur de transduction, avec cette connaissance à la base de thérapies qui ont traité des millions de personnes souffrant de maladies ou de troubles tels que l'hypertension, l'insuffisance cardiaque, le diabète, les maladies gastro-intestinal, de la vessie dysfonction, l'asthme, et de troubles de la déglutition, pour ne en nommer que quelques-uns. À ce jour, le bain de tissu isolé reste un aspect important du développement de médicaments et la recherche fondamentale, car elle permet le tissu de fonctionner comme un tissu. Dans cette leçon JoVE, un protocole officiel est partagée pour démontrer une expérience visuelle et virtuelle en utilisant les données d'une expérience isolée de tissu de bain qui mesure la contraction isométrique, qui permet la caractérisation du récepteur.
Le principal avantage de cette technique est que le tissu est une visnd fonctions en tant que tissu ensemble, avec un résultat physiologique (contraction ou la relaxation) qui est pertinent pour le corps. Ce est une synthèse des étapes (sur les interactions médicament-récepteur, transduction du signal, la deuxième génération de messagerie, les changements dans l'excitabilité musculaire lisse, et les changements dans la fonction des tissus). Alors que d'autres techniques permettent l'étude de chacune de ces étapes (par exemple, la liaison de radioligand pour l'affinité du médicament, la mesure de messagers secondaires), la technique du bain de tissu isolé permet une intégration de l'ensemble de ces étapes 1. Un autre avantage est que le maintien de la fonction des tissus permet de calculer des variables pharmacologiques importantes qui sont plus significative dans un tissu par rapport à un cadre cellulaire; il se agit de plus près à la façon dont les médicaments examinés travailleraient dans le corps dans son ensemble.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesure de la force isométrique comme un outil de recherche est plus de 150 ans, mais il continue d'être la technique prototype pour la caractérisation des récepteurs dans les tissus contractiles 2. La puissance de cette technique réside dans sa simplicité et sa polyvalence: en enregistrant les réponses induites par des concentrations croissantes d'un agoniste en présence ou en l'absence d'un antagoniste, une multitude d'informations peuvent être obtenues sur les caractéristiques pharmacologiques de chaque médicament et le récepteur auquel 5.3 il se lie. Des expériences de ce type Garner également des informations sur la concurrence face à la nature non-concurrentielle des antagonistes utilisés, ainsi que l'hétérogénéité des récepteurs et des effets des médicaments non spécifiques 6-8. Ainsi, avec permutations simples à cette expérience de bain de tissu isolé, un profil pharmacologique relativement complet des récepteurs qui médient induite par l'agoniste contraction musculaire peut être généré.
En termes de agonisme, ee efficacité relative (E max) et la puissance (CE50) d'un agoniste dans un tissu donné peut être calculé et comparé à d'autres agonistes de réponses à une même tissu. Dans notre expérience, le rat aorte thoracique a été incubée avec le véhicule ou la α 1 adrénergique antagoniste du récepteur de la prazosine (5 nM) pendant une heure avant l'addition de l'α 1 adrénergique phenylephrine dans le bain de tissu et pour générer la contraction. La figure 2 présente modifié résultats de la figure 1. Les réponses verts ont été marquées avec la contraction maximale atteinte par PE marqué comme max, la contraction maximale ½ marqué comme tel, puis associé à la concentration de PE qui a provoqué cette réponse. L'identification de ces valeurs est l'identification de la concentration efficace d'un agoniste qui réalise une demi-max (50%) ou réponse CE 50 valeur.
Malheureusement, en utilisant le paramètre agoniste-dépendanteest seul pour déterminer les caractéristiques de liaison aux récepteurs peuvent être compliqués neuf. Idéalement, des expériences supplémentaires en utilisant des antagonistes du récepteur permettent le calcul de deux paramètres importants que sont la clé de la définition de l'interaction entre un médicament et un récepteur: l'-log 10 de la dissociation de l'antagoniste constante (pK B) et le -log 10 molaire de l'antagoniste concentration nécessaire pour provoquer une double déplacement vers la droite de la courbe concentration-réponse (pA 2) 10. Les deux B et K pA 2 de gain leur utilité dans le fait que ce sont des valeurs agonistes indépendante, et reste constante, même entre 11 différents tissus. D'après les données de la figure 2, pK B peut être calculée en utilisant l'équation suivante et basée sur CE 50 valeurs calculées ailleurs:
EC 50 en l'absence de la prazosine = 2 x 10 -8 M
CE 50 dans le préle sens de la prazosine = 7 x 10 -6 M
Résolvez K B dans l'équation suivante:
log (DR-1) = log [B] – log K B
Où:
[B] = concentration antagoniste, ou 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8,3
dr = rapport de dose de CE 50 valeur, en présence de l'antagoniste / CE 50 dans l'absence. Se il ya un déplacement vers la droite, cette valeur sera supérieur à un. Ainsi:
dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M ou 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
Substituer à [B] et dr:
log (350-1) = -8 – log K B
2,54 = -8 – log KB
pK B = 10,54
Cette valeur de la prazosine est compatible avec les valeurs obtenues lorsque la prazosine interagit avec un α 1 adrénergique receptou 12,13, ce qui suggère que le récepteur adrénergique médiation contraction à la phényléphrine est le récepteur adrénergique α 1.
Plusieurs étapes sont essentielles à la réussite de ces expériences. Les tissus doivent rester dans PSS après la dissection afin d'éviter la perte de viabilité tissulaire. Toute préparation musculaire isométrique a un rapport longueur-tension optimale qui génère la force maximale contre tension passive 14,15. Pour l'expérience décrite dans ce protocole, la tension passive optimale a déjà été déterminée par incréments brièvement l'ajout de 0,5 g de tension passive au tissu. Le tissu doit commencer sans tonalité et puis après 30 min d'équilibration, le tissu a été contestée avec une concentration maximale de KCl (80 mM), qui a généré tonalité actif. Ensuite, le tissu a été lavé et laisse revenir à la tonalité de référence. Après 15 min au départ, a été placée un autre 0,5 g de tension passive et ce processus est répété jusqu'à ce qu'un plateau detension active a été obtenue avec une tension passive supplémentaire. Dans des expériences préliminaires, 4 g total de tension passive a été déterminé à atteindre maximale génération de tension active dans les anneaux aortiques, et donc ce montant total de tension est placé sur les anneaux avant équilibration. La procédure, il est préférable de zéro demande de tension passive avant, mais peut être fait à tout moment avant l'expérience. Sur-étirement des tissus, en tout point de l'expérience ou de dissection, aura un impact négatif viabilité des tissus et les résultats expérimentaux. Ce est plus impératif lorsque plaçant les tissus dans le bain, car cette étape a la plus forte probabilité d'étirement excessif. Un lavage adéquat, en nombre et en durée est nécessaire pour les effets reproductibles. Un deuxième défi trop tôt après un premier défi, ou avant tissus sont retournés à la tension de base, se traduira dans les réponses aberrantes. Si l'étude antagonistes / inhibiteurs réversibles, des tissus doivent pas être lavés avant agoniste outre, comme l'INHIBIconcentration Tor sera diminué.
Il ya des avantages et des inconvénients notables aux essais isolés de bain de tissu.
Inconvénients: Les tissus peuvent éprouver différents degrés de dommages pendant l'ablation chirurgicale ou le placement d'anneaux sur des crochets. Depuis la cellule endothéliale est la doublure intérieure de l'anneau aortique, il faut veiller sur le placement de l'anneau sur des crochets afin de ne pas endommager cette couche cellulaire. Les tissus peuvent également avoir nettement différentes longueurs de temps dans lequel elles sont viables dans le bain de tissu, et cela doit être déterminé; pas tous les tissus sont les mêmes. Le long de ces lignes, les tissus peuvent changer dans leur réactivité tout au long de la journée tels que les contrôles de temps deviennent un contrôle nécessaire pour chaque expérience. Un bon exemple en est le cochon de Guinée trachée qui permet d'améliorer la contractilité maximale de 100% lors d'une expérience typique de 8 heures. Les médicaments qui sont faiblement solubles dans l'eau peuvent précipiter dans le PSS. Enfin, un cumulatife ajouts non cumulatifs d'un médicament qui est un agoniste pourrait entraîner des résultats différents si désensibilisation du récepteur à l'agoniste se produit; angiotensine II est un de ces médicaments qui montre tachyphylaxie rapides.
Avantages: Un des principaux avantages des expériences de bain de tissu, ce est qu'il est en temps réel; on peut voir l'expérience telle qu'elle se déroule et peut rapidement tirer des conclusions et de planifier les prochaines étapes, ainsi que dépanner pendant une expérience. Une expérience prend un jour à faire. Tissus multiples peuvent généralement être préparés à partir d'un animal tel qu'un animal peut servir comme son propre contrôle, et qui ajoute la force à une expérience. On peut également isoler le tissu à partir d'autres facteurs afin de tester une réponse relativement pur du tissu au médicament. Expériences in vitro, tels que le système de bain de tissu permettent également l'utilisation d'une petite quantité de médicament par rapport à une expérience in vivo.
Le dispositif expérimental de base décrits ici peuvent êtrelargement modifié pour permettre l'enregistrement de paramètres supplémentaires ou l'introduction d'autres stimuli externes. Par exemple, l'addition d'électrodes pour permettre la stimulation électrique des nerfs innervant de 16,17 terrain. Avec l'ajout de sondes thermiques ou de pH, les effets de la température et du pH sur les réponses contractiles peuvent également être mesurés 18,19. De même, l'oxygène peut être substitué partiellement ou en totalité avec N 2 pour évaluer les effets induits par l'hypoxie. En outre, les mêmes principes de base de la mesure de la contractilité isométrique utilisés dans cette vidéo peuvent être utilisés pour développer des systèmes qui permettent la mesure concomitante de développement et les changements de tension isométrique en calcium intracellulaire 20. la transduction de signal est également facilement étudié, étant donné que les systèmes existent qui peuvent congeler rapidement un échantillon de tissu au cours d'une réaction, de telle sorte que l'activité d'un système de voie de transduction de signal peut être vérifiée biochimiquement.
La variation de equipment qui peut être utilisé pour ce faire est énorme. Tout ce système, soit la main construit ou automatisé, peut être acheté auprès de plusieurs sociétés différentes. Les bains de tissu et les détenteurs de tissus utilisés dans ce protocole étaient (bains de tissus) et main construit (titulaires) soufflé à la main par un atelier d'usinage en interne Michigan State University.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| LabChart Software | ADInstruments | 7.2 | |
| PowerLab (4 channel) | ADInstruments | ML760 | |
| QuadBridge (4 channel) | ADInstruments | ML112 | ML112 |
| Grass Adapter Cable | ADInstruments | MLAC11 | MLAC11 |
| Grass Force-Displacement Transducer | Grass Instrument Co | FT03 | FT03 |
| Grass Transducer Cable | Grass Instrument Co | TAC-7 REV-1 | |
| BNC to BNC Cable | ADInstruments | MLAC01 | |
| IsoTemp 2100 | Fisher Scientific | IC-2100 | |
| Tissue Bath | Multiple Sources | ||
| Physiological Salt Solution | PSS | ||
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Ring Stand | Humboldt MFG Co | H-2122 7 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Tygon Tubing | VWR Scientific | 63010-100 | R-3603 |
| Hose Clamps | Cole-Parmer Instrument Co | 06832-08 | SNP-8 |
| 50ml Muscle Bath | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| 250ml Warming Chambers | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| Gas Dispersion Tube | Ace Glass | 7202-06 | 7202-02 |
| Micrometer | |||
| Custom Stands | |||
| Three-Prong Clamps | VWR International | Talon | |
| S-Connector | VWR International | Talon | |
| Tissue Hooks | Hand Made in House | Custom | |
| Tissue Dissection | |||
| Leica Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | 12562-36 |
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | 160-150 |
| Splinter & Fixation Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | 160-55 |
References
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