Измерение гладких мышцах функции в выделенную ткань баня приложений к фармакологии исследований

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, описанные в этой статье, осуществляются в соответствии с руководящими принципами, установленными уходу и использованию комитета за животными (IACUC) Мичиганского государственного университета по. 1. Система Подготовка и настройка Сделать 5 мкл физиологического солевого раствора (PSS), который является количество, необходимое для сжатия ткани ванны эксперимента, который использует до 50 мл тканевых ваннах; В таблице 2 приведена PSS рецепту. Вычислить общую требуемого объема путем умножения количества тканевые ванны раз превышает объем ванны, а затем умножением на количество требуемых промывок ткани. Используйте таблицу 2 в качестве руководства для принятия PSS. Растворения солей приблизительно в 4 л воды. ПРИМЕЧАНИЕ: ВЭЖХ – Тип I воду рекомендуется Добавить 8 мл 1 М раствора CaCl 2 (147 г / л при использовании дигидрата соли) в растворе, так что конечный раствор 1,6 мМ кальция. Quantum sufficit PSS решение 5 л </ол> Предварительный нагрев системы ткани бане до 37 ° С при включении рециркуляции баню, нагретую воды. Важнейший шаг: Каждый компонент системы является водяной рубашкой, чтобы они были соединены в последовательный друг с другом. Направление потока является критическим – обеспечивать, чтобы вода течет в каждом компоненте по самой низкой колючей связи и на самом высоком колючей связи. Включите систему сбора данных. Включение силовых преобразователей, по крайней мере за 15 мин до эксперимента, чтобы уравновесить температуру. ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство преобразователей силы используют тензодатчики, которые чувствительны к изменениям температуры и проявляют температурный дрейф первоначально после включения питания. Запуск программное обеспечение сбора данных и обеспечить связь с системой сбора данных. Пожалуйста, следуйте инструкциям производство для обеспечения записи данных. Убедитесь, что сила преобразователи калибруются перед ткани помещают в ткани ванны и перед началом записи данных началась; FOllow инструкции производителя для калибровки. Подключите систему ткани бане до 95% O 2/5% СО газового баллона 2 медицинского назначения и убедитесь в отсутствии утечек газа, а затем давление в системе. Заполните ткани ванны резервуары с PSS и позволяют время решения, чтобы достичь оптимальной температуры. Премьер-системы и удалить все пузырьки воздуха в системе и труб. Проверьте ткани ванны аэраторы для обеспечения последовательного решения аэрации, которая оксигенирует буфер PSS и обеспечивает броуновское движение распространять наркотики, которые будут введены в тканевой ванне во время эксперимента. Убедитесь в том, аэрация / пузырьки не вызывает движение ткани, которая будет разрушать записи данных; уменьшить расход газа по мере необходимости. ПРИМЕЧАНИЕ: ткань для ванны и система сбора данных теперь готовы приступить к эксперименту. 2. Подготовка ткани В идеале, рассекают ткани от животного непосредственно перед использованием и поместите непосредственно яNto PSS. ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые ткани могут быть сохранены в PSS в течение ночи при 4 ° С, но соответствующие органы управления должны быть сделано, чтобы проверить функцию ткани после длительного хранения; см раздел 6. Используйте грудной аорты, как ткани в этом упражнении. Обезболить крысу в соответствии с ведомственным руководящим принципам и поместите крысы спинной стороной вниз. Подтвердите обезболивания с помощью схождения крайнем случае и утрате рефлекторной реакции этой болезненной раздражитель. Примечание: Этот протокол использует 70 мг / кг пентобарбитала поставляемого с помощью внутрибрюшинной инъекции. Институциональные рекомендации по грызунов анестезии может отличаться. Создание пневмоторакс, создавая разрез ножницами вдоль диафрагмы в нижней части грудной клетки. Тогда, по-прежнему разрез в нижней части грудной клетки к грудине и пополам. Отсечь или разместить в стороне те органы, которые находятся на верхней части позвоночника и найдите аорты, которая лежит непосредственно вдоль позвоночного столба. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот SТЭП обеспечивает четкое рабочее пространство, чтобы рассекать из аорты. Север все соединения с аортой; от пищевода, легких, и т.д., и сократить аорты перпендикулярно к позвоночнику на уровне диафрагмы. Придерживая аорты с пинцетом и ножницами рассекают аорты от позвоночника. Начните рассечение в нижней части диафрагмы, прилегающей к позвоночнику и работать в направлении сердца. Убедитесь, принять дополнительные меры предосторожности, чтобы не тянуть или перетягивание на ткани аорты, которые могут повредить ткань. Сразу же место аорты в подготовленную рассечение блюдо с PSS. ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение аорты в кольцах лучше всего делать в анатомическом театре блюдо, которое имеет черный фундамент силастиковых. Это дает возможность использования проводов, которые могут быть использованы для иглу аорты и быть прикреплены к чашке, обеспечивая стабильность, а в рассечение блюдо. Черный фон обеспечивает контраст, который помогает рассечение. Следует проявлять осторожность при использовании cannulating проводов, как эндотелиционного слой клеток могут быть удалены с избыточным трением проволоки против просвета сосуда. Возьмем проволоку и сделать небольшой 90 ° угол на одном конце и толкать под углом конец в силиконовой основания для крепления к направляющей проволоки. Поместите все аорту в рассечение блюдо. Удерживая конец направляющей проволоки с пинцетом, а затем осторожно нить провод в просвет аорты. Используйте пинцет, и сдвиньте аорты на проволоку. Когда свободный конец направляющей проволоки видно, кривая плавно проволоки и поместите свободный конец в силиконовой основания тарелки для стабилизации ткани. Использование малых Vännäs ножницы и пинцет, удалите периваскулярной жировой ткани и все другие посторонние ткани, сгустки крови и т.д., пока грудной аорты не появится белый и несколько волокнистым. Удалить очищенный аорты из проволоки и использовать ножницы, чтобы вырезать аорты в кольцах, которые примерно 3-5 мм в ширину. Разместить аорты кольцо на одном из пары TiСГУП крючки, удерживая крючок и с помощью щипцов, чтобы аккуратно сдвиньте кольцо на крючок. Повторите этот процесс со второй крючок. Следите за тем, крючки не клубок; Рисунок 3. Убедитесь, что каждый крючок имеет другой шелковой нити прилагается. Убедитесь, что один крюк имеет малый узлами петлю из шелка, что позволяет для крепления к стеклу или стержня из нержавеющей стали, в то время как другой представляет собой 10-4 см в длину кусок шва, что будет вручную привязан к датчику силы; Рисунок 3. Примечание: После того, как аорта прикреплен к крючкам, ткань готова для установки в ткани ванны; Рисунок 3. Повторите этапы 2.14-2.15, чтобы смонтировать второй аорты кольцо во второй камере ткани ванны. 3. Ткань Размещение в ванной Следует отметить, что в этой системе, ткань сами ванны являются стационарными. В это время заполнить ткани ванны с подогретой, газобетона PSS и позволяют решение приехать в TEMPERATURе. С шелковой нитью, связать один из крючков по подготовке тканей к колышку на стержне из нержавеющей стали. Поместите этот конец в ткани ванны камеры. Подключите стержня в кольцевом основании и поместите другой конец При окрашивании блюдо, заполнены с PSS, чтобы ткань погружается в буфер; Рисунок 3. Поместите стержень и ткани в ткани ванны камеру и убедитесь, что ткань полностью погружен в PSS и стержень находится в безопасности; Рисунок 3. Свяжите другой шов с преобразователем силы и не забудьте оставить провисание шва между тканью и датчика силы. Примечание: Этот провисание будет удален путем регулировки микрометра; Рисунок 3. Повторите эти действия для второго кольца аорты и ткани ванны камеры. 4. Установка пассивный Напряжение Примечание: В каждом ткань имеет длину (Lo), при котором клетки гладких мышц реагировать оптимумыLLY. Предварительные эксперименты для определения оптимального растяжения напряжение, которое достигает эта длина должна быть выполнена для каждого типа ткани должны быть рассмотрены. Крыса грудной аорты имеет оптимальную пассивного растяжения напряжение 4 г. Используйте микрометр / реечной усилить напряженность в 2 г и ждать ткани, чтобы достичь плато. После того, как плато достигается, усилить напряженность еще 2 г и ждать ткани на плато. ПРИМЕЧАНИЕ: В кольцах аорты, после начальное натяжение 2 г поставлена ​​и плато достигается, ткань должна затем расслабиться в ~ 1,6 г. Второе применение 2 г приведет ткани до ~ 3,6 г, из которого ткань снова отдохнуть и напряжение будет уменьшаться. Таким образом, после добавления 4 г общего напряжения, программное обеспечение должно быть указано приблизительно 3,2 г напряженности. Повторите эти действия для второго кольца аорты и ткани ванны камеры. 5. Сбалансированность и медикаментов Изготовление Равновесие ткани дляЧерез 60 мин после нанесения пассивный напряжение в ткани. В равновесной фазы, мыть ткани каждые 15-20 мин. Слейте тканей ванну и заменить PSS с PSS с подогреваемой водохранилища. Примечание: В течение этого времени, ткань будет релаксировать, что указывает на потерю пассивного напряжения. В течение этого времени подготовки препаратов для эксперимента, которые должны быть, по крайней мере в 1000 раз более концентрированным, чем фактическое концентрации в ванне, так что только небольшой объем запасов лекарственного необходима для достижения желаемой концентрации. 6. Исходное вызов В конце периода уравновешивания, мыть ткани в последний раз, за ​​исключением данных, и RE-ZERO все входы. Выберите агониста (соединение, которое вызовет активное сокращение), к которому ткань реагирует. ПРИМЕЧАНИЕ: В крысы грудной аорты, артериальная гладкая мышца активно контракт на агонист альфа-адренорецепторов рецепторов из-за иннервацииткань симпатической нервной системы. Адренергические агонисты, не были бы полезны в кишечных тканей при условии, что адренергические агонисты вызывают релаксацию. В этом случае агонист рецептора, такой как ацетилхолин (холинергической рецептора) могут быть использованы. Альтернативой как фенилэфрин и ацетилхолина является использование агонистов не-рецептора, таких как высокая калия (K), что и первый вызов. В гладких мышцах, высокой K работает косвенно кальциевые каналы открыты, и, таким образом, рассматривается в качестве общего показателя целостности гладких мышц. Выполнение первого вызов или пробуждения вызов путем добавления 10 -5 М фенилэфрин к тканевой ванне. Для достижения этой концентрации в 50 мл ткани ванной, добавить 50 мкл раствора фенилэфрина 10 -2 М. Примечание: 50 мкл в 50 мл PSS является разведение 1/1000, так что конечная концентрация составляет менее чем 1,000x наличии или 10 -5 М. Знание объема и последовательно поддержания объема ткани в ванне сhamber имеет решающее значение для определения окончательной концентрации лекарственного средства. Добавить 10 -5 М фенилэфрин, чтобы ткани ванны и позволяют сжатие до пика, а затем плато, когда наклон данных становится равной нулю. Убедитесь, что для записи каждого экспериментального события, чтобы помочь после экспериментального анализа. После плато, мыть агонист из тщательно опорожнения и заправки ткани ванны камеру с новой PSS. Убедитесь в том, чтобы записать эти события, а также. ПРИМЕЧАНИЕ: эмпирическое правило, что концентрация агониста в ванне снижается в 10 раз с каждой стирки. Хотя, более 3-4 промывки может быть необходимым довести ткань обратно к равновесному базового тона (натяжение). Пусть тканей отдохнуть в базовом тон в течение ~ 10 мин, прежде чем продолжить. 7. Эксперимент ПРИМЕЧАНИЕ: Prazosin, альфа адренергических рецепторов антагонист, будут введены в ткань ванны камере переложить концентрации соотвonse кривую фенилэфрина (PE); это очевидный антагонизм. Для одной ванны, добавить транспортное средство (Н 2 О), в которой растворяют празозин. К другому, добавить соответствующее концентрации празозина. В этом случае, добавить 25 мкл транспортного средства на один бане и 25 мкл 10 -5 М концентрации празозина к другому, чтобы достичь 5 х 10 -9 М или концентрации 5 нМ в ванне. ПРИМЕЧАНИЕ: При добавлении автомобиля кажется ненужным в данном примере, необходимо сделать так при использовании других транспортных средств, которые имеют потенциал, чтобы быть сосудоактивный (например, ДМСО, этанол, этилацетат). Добавьте соответствующее транспортное средство, даже если мало доказательств существует для того, чтобы быть сосудоактивный. Оставьте автомобиль / празозин в банях и не мыть ткани в течение 1 часа. В то время как ткани уравновешивания, подготовить несколько концентрации агониста (PE). Включают в себя широкий диапазон концентраций, от концентрации не добилась ответа (например, </ EM> 10 -9 M PE) в концентрациях, которые превосходят максимальную реакцию (например, 10 -4 M PE). С кривые концентрация-ответ логарифмической природы, сделать шесть отдельных исходных растворов PE (10 -6 -10 -1 М) с помощью серийных разведений от 10 -1 М раствора. Убедитесь, что объем необходим для каждой концентрации немного больше, чем тройной общего объема, необходимого для всех ванн (т.е.> 300 мкл). Перейдем к добавлением агониста, как описано в таблице 1. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент будет генерировать кумулятивной кривой отклика концентрация в PE; каждая итерация учитывает количество вещества, уже добавленный в ванну. Дополнения происходить до тех пор, больше не увеличивают сокращение, или вся кривая плато. Добавить каждой концентрации лекарственного средства по отдельности, пока порог ткани пока не будет достигнута. Если не происходит никаких изменений, добавьте следующий концентрацию вСерия; табл 2. ПРИМЕЧАНИЕ: времени из этих дополнений зависит от агониста используется. Например, норадреналина и сжатие фенилэфрин быстро развивается, и следует плато в течение нескольких минут. С другой стороны, эндотелин-1 сокращение развивается медленно и не может плато в течение почти 45 минут. Другое экспериментов можно сделать на ткани после построения кривой, такие как этот, так долго, как (1) вещество вымывает; и (2) можно показать, что ткань возвращается к нормальной сократительной поведения и не зависит от предыдущих раздражений. Анализ 8. Данные Убедитесь в том, чтобы сохранить данные непосредственно до и после вмешательства (например, проснуться или полный кривая). Найти и установить тканей Базовый уровень для каждой камеры / канала ввода ткань баня, которая поможет в анализе данных. После того, как базовый установлен, найти максимальный ответ для каждой концентрации и записывать чанGE сравнению с исходным. Последовательно перемещения по каждой из концентраций и записывать сдвига базовой линии. Graph полученные данные. Сделайте это в любой программе, графический. ПРИМЕЧАНИЕ: График Pad Prism предназначен для фармакологов, и это идеально подходит для типа эксперимента, представленного здесь.