A medição da função do músculo liso nas Isolado tecido de banho-aplicativos para Farmacologia Research

NOTA: Todos os procedimentos descritos neste trabalho são realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade Estadual de Michigan. 1. Sistema de Preparação e Configuração Adicione 5 L de uma solução de sal fisiológico (PSS), que é a quantidade necessária para um experimento contracção banho de tecido que utiliza cerca de 50 ml de banhos de tecido; ver Tabela 2 para a receita PSS. Calcular o volume total necessário por multiplicação do número de banhos de tecido vezes o volume do banho e em seguida multiplicando pelo número de lavagens de tecidos necessários. Use a Tabela 2 como um guia para fazer PSS. Dissolve-se os sais em cerca de 4 L de água. NOTA: HPLC – Tipo I água é recomendado Adiciona-se 8 ml de 1 M de solução de CaCl 2 (147 g / L de se utilizar o sal di-hidrato) para a solução, de modo que a solução final é de 1,6 mM de cálcio. Solução PSS Quantum sufficit a 5 L. </ol> Pré-aqueça o sistema de banho de tecido a 37 ° C por ligar o banho de água aquecida a recirculação. Passo Crítica: Cada componente do sistema é jaqueta de água, assegurar que eles estão ligados em série uns aos outros. A direção do fluxo é crítica – garantir que os fluxos de água para cada componente com o menor conexão farpado e, ao mais alto conexão farpado. Ligue sistema de aquisição de dados. Ligue os transdutores de força, pelo menos, 15 minutos antes do experimento para equilibrar a temperatura. NOTA: A maioria dos transdutores de força empregar medidores de tensão que são sensíveis a variações de temperatura e exibem deriva térmica inicialmente depois que a energia é aplicada. Lançamento software de aquisição de dados e garantir a conexão com o sistema de aquisição de dados. Por favor, siga as instruções de fabricação para permitir a gravação de dados. Certifique-se que os transdutores de força são calibrados antes de tecido é colocado no banho de tecidos e antes de gravação de dados já começou; foinstruções do fabricante Llow para calibração. Ligue o sistema de banho de tecido a um 95% de O2 / 5% de CO 2 cilindro de gás de grau médico e verifique se há vazamentos de gás e, em seguida, pressurizar o sistema. Encha os reservatórios de banho tecido com PSS e permitir que o tempo de solução para atingir a temperatura ideal. Primeiro o sistema e remover as bolhas de ar dentro do sistema e tubos. Verifique aeradores de banho tecido para garantir a aeração solução consistente, que oxigena o tampão PSS e proporciona movimento browniano para distribuir drogas que serão introduzidas no banho de tecidos durante o experimento. Certifique-se de aeração / bolhas não causar o movimento do tecido, o que vai atrapalhar as gravações de dados; diminuir o fluxo de gás, conforme necessário. NOTA: O banho de tecidos e sistemas de aquisição de dados agora está pronto para iniciar a experiência. 2. Preparação de tecidos Idealmente, dissecar os tecidos a partir do animal imediatamente antes do uso e colocar directamente into PSS. NOTA: Alguns tecidos podem ser salvos no PSS noite a 4 ° C, mas os controles apropriados deve ser feito para validar a função do tecido após um armazenamento prolongado; veja Seção 6. Use a aorta torácica como o tecido neste exercício. Anestesiar o rato, de acordo com as diretrizes institucionais e coloque o lado dorsal do rato para baixo. Confirme anesthetization via um dedo do pé-pitada ea perda de resposta reflexa a esse estímulo doloroso. NOTA: Este protocolo utiliza 70 mg / kg de pentobarbital fornecido através de uma injecção intraperitoneal. Diretrizes institucionais para anestesia roedor pode ser diferente. Criar um pneumotórax, criando uma incisão com tesoura ao longo do diafragma na parte inferior da caixa torácica. Em seguida, continuar a incisão da parte de baixo da caixa torácica para o esterno e bifurcar. Dissecar fora ou colocar de lado os órgãos que estão no topo da coluna vertebral e localize a aorta, que se encontra diretamente ao longo da coluna vertebral. NOTA: Este étep fornece um espaço de trabalho claro para dissecar a aorta. Sever todas as ligações à aorta; a partir do esófago, pulmão, etc, e cortar a aorta perpendicular à coluna vertebral ao nível do diafragma. Suavemente segurar a aorta com uma pinça e utilize uma tesoura para dissecar a aorta a partir da espinha. Comece a dissecção na área inferior do diafragma ao lado da coluna vertebral e do trabalho em direção ao coração. Certifique-se de tomar cuidado extra para não puxar ou puxão na tecido aórtico, o que pode danificar o tecido. Colocar imediatamente a aorta no prato dissecção preparado contendo PSS. NOTA: A dissecção da aorta em anéis é o melhor feito em um prato de dissecação que tem um silastic fundação preto. Isto permite a utilização de fios que podem ser usados ​​para canular a artéria aorta e ser fixada ao prato, proporcionando estabilidade ao mesmo tempo no prato de dissecação. O fundo preto fornece contraste que auxilia dissecção. Cuidados devem ser tomados na utilização de fios canulação como o endotelialcamada de células ial pode ser removido com um excesso de atrito do fio contra o lúmen do vaso. Tomar um fio e fazer um pequeno ângulo de 90 ° em uma extremidade e empurrar a extremidade em ângulo para a base de silastic para ancorar o fio de guia. Coloque toda a aorta no prato dissecção. Segurar a extremidade do fio de guia, com uma pinça, e, em seguida, passe suavemente o fio no interior do lúmen da aorta. Use uma pinça e deslize a aorta para o fio. Quando a extremidade livre do fio de guia é visível, o fio suavemente curva e colocar a extremidade livre para a fundação de silastic do prato para estabilizar o tecido. Usando pequenos Vannas tesoura e pinça, retire o tecido adiposo perivascular e todos os outros tecidos estranhos, coágulos de sangue, etc., até a aorta torácica aparece em branco e um pouco fibrosa. Remover a aorta a partir de arame limpa e utilize uma tesoura para cortar em anéis da aorta, que são cerca de 3-5 mm de largura. Inserir um anel aórtico de um de um par de tiganchos ssue por segurar o gancho e usando uma pinça para deslizar suavemente o anel no gancho. Repita este processo com o segundo gancho. Tome cuidado para garantir os ganchos não emaranhado; veja a Figura 3. Verifique se cada gancho tem um fio de seda diferente anexado. Verificar que um gancho tem um pequeno laço de seda atado que permite a ligação de um vidro ou uma haste de aço inoxidável, enquanto que o outro é uma peça 10-4 cm de comprimento de sutura que vai ser amarrado o transdutor de força à mão; veja a Figura 3. Observação: Uma vez que a aorta é fixada aos ganchos, o tecido é preparado para ser montado no banho de tecido; veja a Figura 3. Repita os passos de 2,14-2,15, para montar um segundo anel aórtico na segunda câmara do banho de tecido. 3. Colocação Tissue em Bath Note-se que neste sistema, os próprios banhos de tecido são estacionários. Neste momento, preencher os banhos de tecido com aquecido, PSS aerado e permitir que a solução para vir a temperature. Com a sutura de seda, amarrar um dos ganchos na preparação de tecido para o pino na vara de aço inoxidável. Coloque este final para a câmara de banho de tecido. Ligue a vara a um stand anel e coloque a outra extremidade no prato de coloração com PSS para manter o tecido imerso em tampão; veja a Figura 3. Coloque a haste e tecido na câmara de banho de tecidos e certifique-se que o tecido é totalmente imerso no PSS e da haste é segura; veja a Figura 3. Amarre a outra sutura para o transdutor de força e certifique-se de deixar uma folga na sutura entre o tecido e o transdutor de força. NOTA: Este folga vai ser removido através do ajuste do micrómetro; veja a Figura 3. Repita essas etapas para o segundo anel e banho de tecidos câmara aórtica. 4. Definir tensão passiva NOTA: Cada tecido tem um comprimento (Lo) em que células musculares lisas responder optimally. As experiências preliminares para determinar a tensão de alongamento óptimo que alcança este comprimento devem ser realizados para cada tipo de manipulação de tecidos a ser examinado. O rato aorta torácica tem uma tensão de alongamento passivo ideal de 4 g. Use o micrômetro / cremalheira e pinhão para aumentar a tensão de 2 g e esperar que o tecido para chegar planalto. Uma vez patamar é atingido, aumentar a tensão de 2 g e outra esperar para o tecido para estabilizar. NOTA: Nos anéis de aorta, após a tensão inicial de 2 g definiu e planalto atingido, o tecido deve então relaxar a ~ 1,6 g. Uma segunda aplicação de 2 g iria levar o tecido a ~ 3,6 g, a partir do qual o tecido novamente irá relaxar e tensão irá diminuir. Assim, depois de ter adicionado 4 g de tensão total, o software deve indicar cerca de 3,2 g de tensão. Repita essas etapas para o segundo anel e banho de tecidos câmara aórtica. 5. Equilíbrio e Confecção de Drogas Equilibrar a tecido para60 min após a aplicação de tensão passiva para o tecido. Durante a fase de equilíbrio, lavar o tecido a cada 15-20 min. Escorra o banho de tecidos e substituir o PSS com PSS de um reservatório aquecido. NOTA: Durante este tempo, o tecido irá relaxar, o que é indicado pela perda de tensão passiva. Durante este tempo, preparar medicamentos para o experimento, que necessitam de ser de pelo menos 1000 vezes mais concentrada que a concentração real no banho, de modo que apenas um pequeno volume da reserva de fármaco necessária para atingir a concentração desejada. 6. desafio inicial No final do período de equilíbrio, lavar o tecido um tempo final, com excepção de dados, e re-zero de todas as entradas. Escolher um agonista (composto que irá provocar a contracção activo) ao qual o tecido responde. NOTA: No rato aorta torácica, o músculo liso arterial irá contrair ativamente para um agonista do receptor adrenérgico alfa devido à inervação dotecido pelo sistema nervoso simpático. Um agonista adrenérgico não seria útil em tecidos intestinais dado que os agonistas adrenérgicos causar relaxamento. Neste caso, um agonista de receptor, tais como acetilcolina (receptor colinérgico) poderia ser utilizado. Uma alternativa para a fenilefrina e a acetilcolina é a utilização de um agonista não-receptoras tais como níveis elevados de potássio (K) como o primeiro desafio. No músculo liso, K elevado opera para indirectamente os canais abertos de cálcio e, portanto, vistos como um índice geral da integridade do músculo liso. Execute o primeiro desafio ou o desafio de despertar pela adição de 10 -5 M fenilefrina ao banho de tecidos. Para atingir esta concentração em 50 mL de banho de tecidos, adicionar 50 ul de uma solução de fenilefrina 10 -2 M. NOTA: 50 ul em 50 ml de PSS é uma diluição 1 / 1.000, de modo que a concentração final é de 1.000x inferior a lingua, ou 10 -5 M. Conhecimento de volume e manutenção constante do volume dentro do banho de tecido cHamber é crítico para a determinação da concentração final da droga. Adicionar 10 -5 M fenilefrina ao banho de tecidos e permitir a contracção de pico e, em seguida, planalto, quando a inclinação dos dados torna-se zero. Certifique-se de gravar cada evento experimental para auxiliar a análise pós-experimental. Depois de planalto, lave o agonista para fora completamente por esvaziamento eo reenchimento da câmara de banho de tecido com o novo PSS. Certifique-se de registrar esses eventos também. NOTA: A regra de ouro é que a concentração de agonista no banho é reduzida 10 vezes com cada lavagem. Embora, mais do que 3-4 lavagens podem ser necessários para pôr o tecido de volta para baixo para o seu tom de linha de base de equilíbrio (tensão). Deixe o resto do tecido em tom de linha de base para ~ 10 min antes de prosseguir. 7. Experiment NOTA: Prazosin, um antagonista dos receptores adrenérgicos alfa, será apresentado à câmara de banho de tecido para mudar a resp concentraçãocurva onse à fenilefrina (PE); este é um antagonismo demonstrável. Para um banho, adicionar o veículo (H 2 O) em que prazosina foi dissolvido. Para outro, adicione a concentração adequada de prazosin. Neste exemplo, adicionar 25 uL de veículo a um banho e 25 ul de 10 -5 M de concentração prazosina para o outro para obter um 5 x 10 -9 M ou uma concentração de 5 nM no banho. NOTA: Embora a adição de veículo parece desnecessária neste exemplo, é imperativo fazê-lo quando se utiliza outros veículos que têm um potencial para ser vasoactivo (por exemplo, DMSO, etanol, acetato). Adicione o veículo correspondente, mesmo que pouca evidência existe para que seja vasoativas. Deixar veículo / prazosina nos banhos e não lavar o tecido durante 1 hora. Embora os tecidos são equilibrante, preparar várias concentrações de agonista (PE). Incluem uma vasta gama de concentrações, a partir das concentrações que não induz qualquer resposta (por exemplo, </ Em> 10 -9 M PE) para concentrações que ultrapassam a resposta máxima (por exemplo, 10 -4 M PE). Desde curvas concentração-resposta são logarítmicas na natureza, fazer seis soluções separadas banco de PE (10 -6 -10 -1 M) através de diluições em série a partir da solução estoque 10 -1 M. Certifique-se que o volume necessário para cada concentração é ligeiramente maior do que o triplo do volume total necessário para todos os banhos (ie> 300 ul). Continuar a adição de agonista, como descrito na Tabela 1. NOTA: Esta experiência vai gerar uma curva de resposta concentração cumulativa ao PE; cada iteração leva em conta a quantidade de substância já adicionado ao banho. Adições ocorrer até que já não aumentar a contração, ou de toda a curva atingiu patamar. Adicionar a cada concentração de droga individualmente até que o limite do tecido é alcançada. Se não houver mudança, adicionar o próximo concentração nosérie; ver Tabela 2. NOTA: O calendário destas adições depende do agonista utilizado. Por exemplo, norepinefrina e contração fenilefrina se desenvolve rapidamente, e deve platô em poucos minutos. Em contrapartida, a endotelina-1 contração desenvolve lentamente e pode não planalto para perto de 45 min. Outra experimentação pode ser feito sobre o tecido, após a construção de uma curva, tal como este, desde que (1) a substância lavagens para fora; e (2) que possa ser demonstrado que o tecido volta ao comportamento normal contrátil e não é afetado pelos estímulos anteriores. Análise 8. Dados Certifique-se de salvar os dados imediatamente antes e depois de uma intervenção (por exemplo, acordar ou curva cheia). Encontrar e definir a linha de base do tecido para cada canal de câmara / input banho de tecidos, o que ajudará na análise de dados. Uma vez que a linha de base é definida, encontrar a resposta máxima para cada concentração, e registrar o change a partir da linha de base. Sequencialmente percorrer cada uma das concentrações e registrar a mudança de linha de base. Gráfico os dados resultantes. Fazei isto em qualquer programa gráfico. NOTA: Graph Pad Prism é concebido para farmacologista, e este é ideal para o tipo de experiência aqui apresentada.