Die Messung der Smooth Muscle Function in den Isolated Tissue Bath-Anwendungen Pharmakologie Forschung

HINWEIS: Alle in diesem Dokument beschriebenen Verfahren werden nach den Richtlinien der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der Michigan State University gegründet geführt. 1. Systemvorbereitungs und Setup Achten 5 l physiologischer Kochsalzlösung (PSS), die die für eine Gewebebad Kontraktion Experiment, das bis zu 50 ml Gewebebäder verwendet benötigte Menge ist; siehe Tabelle 2 PSS Rezept. Berechnen insgesamt erforderliche Volumen durch die Anzahl der Gewebebädern Badumwälzungen und anschließende Multiplikation mit der Anzahl der erforderlichen Gewebe Wäschen. Verwenden Sie Tabelle 2 als Leitfaden für die Herstellung von PSS. Auflösen der Salze in etwa 4 l Wasser. HINWEIS: HPLC – Typ I Wasser wird empfohlen 8 ml 1 M CaCl 2 -Lösung (147 g / l Bei Verwendung des Dihydrat-Salz) zu der Lösung, so dass die Gesamtlösung ist 1,6 mM Calcium. Quanten sufficit PSS Lösung auf 5 L. </ol> Vorheizen Gewebebad System auf 37 ° C durch Einschalten der rezirkulierenden erhitztes Wasserbad. Critical Schritt: Jede Komponente des Systems ist mit Wassermantel, sicherzustellen, dass sie in Serien miteinander verbunden sind. Die Durchflussrichtung ist von entscheidender Bedeutung – dafür sorgen, dass Wasser fließt in jede Komponente auf dem niedrigsten Stacheldraht-Anschluss und bei der höchsten Stacheldraht Verbindung. Schalten Sie Datenerfassungssystem. Macht auf den Kraftaufnehmer mindestens 15 min vor dem Experiment zu temperieren. HINWEIS: Die meisten Kraftaufnehmer beschäftigen Dehnungsmessstreifen, die empfindlich auf Temperaturschwankungen sind und eine thermische Drift zunächst nach Spannung gesetzt wird. Starten Sie Software zur Datenerfassung und gewährleisten Zusammenhang mit Datenerfassungssystem. Bitte folgen Herstellung Anweisungen zur Aktivierung Datenaufzeichnung. Achten Sie darauf, die Kraftaufnehmer vor Gewebe im Gewebe Bad und vor Datenaufzeichnung gestartet platziert kalibriert; follow Anweisungen des Herstellers für die Kalibrierung. Schließen Sie das Gewebebad System zu einem 95% O 2/5% CO 2 für medizinische Zwecke Gasflasche und auf Gaslecks und dann das System drucklos. Füllen Sie die Gewebebad Behälter mit PSS und die Lösung Zeit, um eine optimale Temperatur zu erreichen. Prime das System und entfernen Sie Luftblasen im System und Schläuche. Prüfen Gewebebad Belüfter konsistente Lösung Belüftung, die die PSS-Puffer oxygeniert und liefert die Brownsche Bewegung, Medikamente, die im Gewebebad während des Experiments eingeführt wird verteilen gewährleisten. Stellen Sie sicher, Belüftung / Blasen nicht Gewebebewegung, die Datenaufzeichnungen stören verursachen; verringern Gasstrom nach Bedarf. HINWEIS: Die Gewebebad und Datenerfassungssystem sind nun bereit, das Experiment zu starten. 2. Gewebepräparation Idealerweise sezieren Gewebe aus dem Tier unmittelbar vor der Verwendung und kann direkt into PSS. HINWEIS: Einige Gewebe können in PSS über Nacht bei 4 ° C gespeichert werden, aber entsprechende Kontrollen muss getan werden, um Gewebefunktion nach längerer Lagerung zu validieren; siehe Abschnitt 6. Verwenden Sie die Aorta als das Gewebe in dieser Übung. Anesthetize die Ratte in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts und legen Sie die Rattenrückenseite nach unten. Betäubung Bestätigen über eine Zehen Prise und dem Verlust der Reflexantwort auf diesen schmerzhaften Reiz. Hinweis: Dieses Protokoll verwendet 70 mg / kg Pentobarbital durch eine intraperitoneale Injektion verabreicht. Richtlinien des Instituts für Nager Anästhesie können abweichen. Erstellen eines Pneumothorax durch Herstellen eines Einschnitts mit einer Schere entlang der Membran an der Unterseite der Rippen. Dann setzen die Inzision von der Unterseite des Brustkorbs zum Sternum und halbieren. Präparieren Sie weg oder legen beiseite jene Organe, die an der Spitze der Wirbelsäule sind und suchen Sie die Aorta, die direkt entlang der Wirbelsäule liegt. HINWEIS: Diese step bietet eine klare Arbeitsraum zu sezieren die Aorta. Sever alle Verbindungen zu der Aorta; aus der Speiseröhre, der Lunge usw., und schneiden die Aorta senkrecht zur Wirbelsäule in der Ebene der Membran. Halten Sie das Aorta mit einer Pinzette und mit einer Schere die Aorta von der Wirbelsäule zu sezieren. Starten Sie die Dissektion in der unteren Membranfläche angrenzend an die Wirbelsäule und die Arbeit zum Herzen hin. Achten Sie darauf, zusätzliche Vorsichtsmaßnahme, um nicht ziehen oder zerren an der Aortagewebe, die das Gewebe schädigen können zu nehmen. Unmittelbar danach die Aorta in die vorbereitete Dissektion Schale mit PSS. HINWEIS: Dissektion der Aorta in Ringe am besten in einem Seziertisch Gericht, das einen schwarzen Silastic Stiftung hat getan. Dies ermöglicht die Verwendung von Drähten, die verwendet werden können, um die Aorta kanülieren und an der Schale befestigt werden, wodurch die Stabilität während der Dissektion Schale. Der schwarze Hintergrund bietet dagegen das Sezierung hilft. Es sollte bei Verwendung Kanülieren Drähte Endothels entnommen werdenial Zellschicht kann mit überschüssiger Reibung der Draht gegen das Lumen des Gefäßes entfernt werden können. Werfen Sie einen Draht und einen kleinen Winkel von 90 ° an einem Ende und drücken Sie den abgewinkelten Ende in das Silastic Grundlage, um den Führungsdraht zu verankern. Legen Sie die gesamte Aorta in der Dissektion Gericht. Halten Sie das Ende des Führungsdrahtes mit einer Pinzette, und dann sanft führen Sie das Kabel in das Lumen der Aorta. Verwenden einer Pinzette, und schieben Sie die Aorta auf den Draht. Wenn das freie Ende des Führungsdrahtes zu sehen ist, die Kurve der Draht vorsichtig und legen Sie das freie Ende in die Silastic Gründung der Schale, um das Gewebe zu stabilisieren. Mit kleinen Vannas Schere und Pinzette, entfernen Sie die perivaskulären Fettgewebe und alle anderen Fremdgewebe, Blutgerinnsel, usw., bis der thorakalen Aorta erscheint weiß und etwas faserig. Entfernen Sie die gereinigt Aorta aus Draht und mit einer Schere die Aorta in Ringe, die etwa 3-5 mm in der Breite sind abgeschnitten. Ein Aortaring auf einer von einem Paar von tiUSGABE Haken, indem Sie den Haken und mit einer Pinzette vorsichtig schieben Sie den Ring auf Haken. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem zweiten Haken. Achten Sie darauf, um die Haken zu gewährleisten nicht verheddern; siehe Abbildung 3. Überprüfen Sie, dass jeder Haken hat eine andere Seidenfaden befestigt. Überprüfen Sie, ob ein Haken hat einen kleinen verknoteten Schleife aus Seide, die zur Befestigung an einer Glas- oder Edelstahlstange ermöglicht, während die andere ist eine 4.10 cm langes Stück Faden, der von Hand gebunden mit dem Kraftaufnehmer sein wird; siehe Abbildung 3. HINWEIS: Wenn die Aorta an den Haken befestigt ist, ist das Gewebe, bereit, in das Gewebebad angebracht zu werden; siehe Abbildung 3. Wiederholen Sie die Schritte von 2,14 bis 2,15, um eine zweite Aortenring im zweiten Gewebebad Kammer montieren. 3. Die Gewebe Platzierung in Bath Man beachte, dass in diesem System werden die Gewebebädern selbst stationär sind. Zu dieser Zeit füllen die Gewebebäder mit warmen, belüfteten PSS und lassen Sie die Lösung zu kommen, um Temperature. Mit der Seidenfaden, binden eine der Haken an der Gewebepräparation mit dem Stift auf dem Edelstahlstange. Dieses Ende in das Gewebe Badkammer. Schließen Sie den Stab zu einem Ringständer und das andere Ende in der Färbung Gericht mit PSS gefüllt, um Gewebe in Puffer eingetaucht zu halten; siehe Abbildung 3. Setzen Sie den Stab und Gewebe im Gewebebad Kammer und stellen Sie sicher, das Gewebe ist vollständig in PSS eingetaucht und der Stab ist sicher; siehe Abbildung 3. Binden Sie die andere Naht auf den Kraftaufnehmer und stellen Sie sicher, um ein Durchhängen in der Naht zwischen dem Gewebe und den Kraftaufnehmer zu verlassen. HINWEIS: Dieser Durchhang wird durch Anpassung des Mikrometer entfernt werden; siehe Abbildung 3. Wiederholen Sie diese Schritte für die zweite Aortenring und Gewebebad Kammer. 4. Einstellen Passive Tension HINWEIS: Jedes Gewebe hat eine Länge (Lo), an der glatten Muskelzellen reagieren optimally. Vorversuche die optimale Streckziehspannung, welche erzielt diese Länge ist für jeden einzelnen Gewebetyp durchgeführt werden, zu prüfen, zu bestimmen. Die Brustaorta von Ratten hat eine optimale passive Dehnungsspannung von 4 g. Verwenden Sie die Mikrometer / Zahnstange und Ritzel, um die Spannung zu erhöhen, 2 g und warten auf das Gewebe zu Plateau zu erreichen. Sobald Plateau erreicht ist, erhöhen Spannung eine weitere 2 g und warten auf das Gewebe zur Stabilisierung. HINWEIS: In den Aortenringe, nachdem die Anfangsspannung von 2 g ist untergegangen und Plateau erreicht, sollte das Gewebe dann auf ~ 1,6 g entspannen. Eine zweite Anwendung von 2 g würde das Gewebe zu bringen ~ 3,6 g, aus dem das Gewebe wieder zu entspannen und die Spannung nimmt ab. Somit nach Zugabe von 4 g Gesamtspannung, sollte die Software angeben etwa 3,2 g Spannung. Wiederholen Sie diese Schritte für die zweite Aortenring und Gewebebad Kammer. 5. Die Gleichgewichtseinstellung und Arzneimittelherstellung Äquilibrieren Sie die Gewebe für60 min nach dem Auftragen passive Spannung auf das Gewebe. Während des Gleichgewichtsphase, waschen Sie die Gewebe alle 15-20 min. Lassen Sie das Gewebe Bad und ersetzen Sie die PSS mit PSS aus einem Reservoir erwärmt. HINWEIS: Während dieser Zeit wird das Gewebe zu entspannen, die durch den Verlust der passive Spannung angedeutet ist. Während dieser Zeit der Zubereitung von Drogen für den Versuch, die mindestens 1.000 mal konzentrierter als die tatsächliche Konzentration in dem Bad benötigen, so dass nur ein kleines Volumen des Medikaments Lager benötigt wird, um die gewünschte Konzentration zu erreichen. 6. Erste Herausforderung Am Ende des Äquilibrierungsperiode, waschen das Gewebe ein letztes Mal, Daten speichern und wieder auf Null alle Eingänge. Wählen Sie einen Agonisten (Verbindung, die aktive Kontraktion verursachen wird), auf die das Gewebe reagiert. HINWEIS: In der Brustaorta von Ratten, die arteriellen glatten Muskeln aktiv zu einer alpha-adrenergen Rezeptor-Agonisten Vertrag aufgrund der Innervation derGewebe durch das sympathische Nervensystem. Ein adrenergen Agonisten nicht sinnvoll in Darmgewebe sein da adrenergen Agonisten verursachen Entspannung. In diesem Fall könnte ein Rezeptor-Agonisten, wie Acetylcholin (cholinergen Rezeptor) verwendet werden. Eine Alternative zu beiden Phenylephrin und Acetylcholin ist, eine Nicht-Rezeptor-Agonisten, wie hohen Kalium (K) als den ersten Auftrag. In der glatten Muskulatur arbeitet hohen K indirekt offenen Kalziumkanäle und damit als ein allgemeiner Index der glatten Muskulatur Integrität angesehen. Führen Sie die erste Herausforderung oder den Wake-up Herausforderung durch Zugabe von 10 -5 M Phenylephrin dem Gewebebad. Um diese Konzentration in 50 ml Gewebebad zu erreichen, fügen Sie 50 ul einer 10 -2 M Phenylephrin Lösung. HINWEIS: 50 ul in 50 ml PSS ist ein 1/1000-Verdünnung, so dass die Endkonzentration 1,000x weniger als Lager oder 10 -5 M. Die Kenntnis der Menge und konsistente Pflege des Volumens innerhalb Gewebebad chamber ist entscheidend für die Bestimmung der endgültigen Arzneistoffkonzentration. Zugabe von 10 -5 M Phenylephrin dem Gewebebad und erlauben die Kontraktion zu Spitze und dann Plateau, wenn die Steigung der Daten zu Null wird. Stellen Sie sicher, jeden experimentellen Ereignis post experimentelle Analyse helfen zu erfassen. Nach dem Hochplateau, waschen Sie die Agonisten gründlich durch Entleeren und Auffüllen des Gewebebad Kammer mit neuen PSS. Stellen Sie sicher, diese Ereignisse als auch aufzuzeichnen. ANMERKUNG: Eine Faustregel ist, dass die Konzentration des Agonisten in der Wanne verringert 10fach mit jeder Wäsche. Obwohl, kann mehr als 3-4 Wäschen notwendig sein, um das Gewebe wieder auf sein Gleichgewicht Grundlinientonus (Zug) zu bringen. Lassen Sie das Gewebe Rest zu Studienbeginn Ton für ~ 10 min, bevor Sie fortfahren. 7. Experiment HINWEIS: Prazosin, ein alpha-adrenergen Rezeptor-Antagonist, wird dem Gewebebad Kammer eingebracht, um die Konzentration bzw. verschiebenonse Kurve auf Phenylephrin (PE); dies ist eine nachweisbare Antagonismus. Einem Bad, fügen dem Fahrzeug (H 2 O) in dem Prazosin wurde aufgelöst. Zum anderen, fügen Sie die entsprechende Konzentration von Prazosin. In diesem Fall werden 25 ul Fahrzeug einem Bad und 25 ul von 10 -5 M Konzentration von Prazosin zu der anderen, um eine 5 x 10 -9 M oder 5 nM Konzentration in dem Bad zu erreichen. Anmerkung: Während der Zugabe des Fahrzeugs unnötig erscheint in diesem Beispiel, ist es zwingend, so zu tun, als mit anderen Fahrzeugen, die eine potentielle vasoaktiven zu sein (beispielsweise DMSO, Ethanol, Acetat) haben. Fügen Sie die entsprechenden Fahrzeugs, auch wenn wenig Beweise gibt es für vasoaktive sein. Lassen Fahrzeug / Prazosin in den Bädern und nicht das Gewebe Waschen für 1 Stunde. Während Gewebe im Gleichgewicht, bereiten mehrere Konzentrationen von Agonisten (PE). Umfassen ein breites Spektrum von Konzentrationen von Konzentrationen entlocken keine Antwort (zB </ Em> 10 -9 M PE) zu Konzentrationen, die die maximale Reaktion (übertreffen zB 10 -4 M PE). Seit Konzentrations-Wirkungs-Kurven sind logarithmisch in der Natur, machen sechs separate Stammlösungen von PE (10 -6 bis 10 -1 M) über Verdünnungsreihen von der 10 -1 M-Stammlösung. Sicherstellen, dass die für jede Konzentration benötigte Volumen etwas größer als das Dreifache des Gesamtvolumens für alle Bäder (dh> 300 ul) benötigt. Mit Hinzufügen Agonisten, wie in Tabelle 1 beschrieben. HINWEIS: Dieses Experiment wird eine kumulative Konzentrations-Wirkungs-Kurve auf PE zu generieren; jede Iteration berücksichtigt die Menge der Substanz bereits an dem Bad zugesetzt. Zugänge auftreten, bis sie Kontraktion nicht mehr zu erhöhen, oder die gesamte Kurve ein Plateau erreicht hat. Fügen Sie jede Wirkstoffkonzentration einzeln, bis das Gewebe Schwelle erreicht ist. Wenn keine Änderung auftritt, fügen Sie den nächsten Konzentration in derSerie; siehe Tabelle 2. Anmerkung: Der Zeitpunkt dieser Zusätze hängt von der Agonist verwendet. Zum Beispiel, Noradrenalin und Phenylephrin Kontraktion entwickelt sich schnell, und sollte innerhalb weniger Minuten ein Plateau. Im Gegensatz dazu entwickelt Endothelin-1 Kontraktion langsam und nicht für fast 45 Minuten ein Plateau. Andere Experimente können auf dem Gewebe nach dem Aufbau einer Kurve, wie dies getan werden kann, solange wie (1) die Substanz auswäscht; und (2) gezeigt werden kann, dass das Gewebe wieder in den normalen Kontraktionsverhalten und wird nicht durch den vorhergehenden Stimulationen beeinflusst. 8. Datenanalyse Achten Sie darauf, die Daten unmittelbar vor und nach einem Eingriff zu sparen (zB aufwachen oder Voll Kurve). Suche und den Gewebegrundlinie für jedes Gewebe Badkammer / Eingangskanal, der in der Datenanalyse helfen werden. Sobald die Grundlinie gesetzt wird, suchen Sie die maximale Reaktion für jede Konzentration, und notieren Sie die change von der Grundlinie. Nacheinander durch jede der Konzentrationen bewegen und notieren Sie die Grundlinienverschiebung. Graph der resultierenden Daten. Tun Sie dies in jedem Grafik-Programm. HINWEIS: Graph Pad Prism für Pharmakologen gestaltet, und dies ist für die Art des Experiments hier vorgestellt.