Meting van de gladde spieren Functie in het Geïsoleerde Tissue Bath-applicaties om Farmacologie Onderzoek

OPMERKING: Alle procedures beschreven in dit document worden uitgevoerd op basis van door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Michigan State University richtlijnen. 1. Systeem Voorbereiding en Setup Voeg 5 L van een fysiologische zoutoplossing (PSS), dat is de hoeveelheid die nodig is voor een weefselbad samentrekking experiment up gebruikt om 50 ml weefselbaden; zie tabel 2 voor PSS recept. Bereken de totale vereiste volume van het aantal weefselbaden keer te vermenigvuldigen badvolume en vervolgens vermenigvuldigen met het aantal gewenste weefsel wasbeurten. Gebruik tabel 2 als een gids voor het maken van PSS. Los het zout ongeveer 4 liter water. OPMERKING: HPLC – Type I water wordt aanbevolen Voeg 8 ml 1 M CaCl2-oplossing (147 g / l bij gebruik van het dihydraat zout) aan de oplossing, zodat het einde oplossing 1,6 mM calcium. Quantum sufficit PSS oplossing 5 L. </ol> Verwarm het weefselbad systeem tot 37 ° C door te draaien aan het recirculerende verwarmde waterbad. Kritische stap: Elke component van het systeem watermantel, opdat zij die serieel met elkaar. De stromingsrichting is kritisch – waarborgen dat water stroomt in elke component aan scherpe weerhaken verbinding en op het hoogste weerhaken verbinding. Schakel data-acquisitie systeem. Macht op de krachtopnemers ten minste 15 minuten voor het experiment om de temperatuur in evenwicht. OPMERKING: De meeste krachtopnemers in dienst rekstroken die gevoelig zijn voor schommelingen in temperatuur zijn en vertonen thermische drift aanvankelijk na de voeding wordt ingeschakeld. Start data acquisitie software en zorgen kader gegevensverzamelsysteem. Volg de fabricage instructies voor het inschakelen van gegevensregistratie. Zorg ervoor dat de krachtopnemers worden gekalibreerd voordat het weefsel wordt geplaatst in het weefsel bad en voordat de gegevens opname is gestart; follow instructies van de fabrikant voor kalibratie. Sluit het weefsel bad systeem om een 95% O 2/5% CO 2 medische kwaliteit gasfles en gaslekken en vervolgens het systeem onder druk. Vul het weefsel bad reservoirs met PSS en laat de oplossing tijd om de optimale temperatuur te bereiken. Prime het systeem en verwijder eventuele luchtbellen in het systeem en slangen. Controleer weefsel bad beluchters om consistente oplossing beluchting, waarbij de PSS buffer van zuurstof en biedt Brownse beweging om geneesmiddelen die in het weefsel bad zal worden ingevoerd tijdens het experiment te verspreiden waarborgen. Zorg ervoor dat de beluchting / bellen veroorzaakt geen weefsel beweging, die data opnames zal verstoren; verlagen gasstroom nodig. OPMERKING: Het weefsel bad en data-acquisitie systeem zijn nu klaar om het experiment te starten. 2. Tissue Voorbereiding Idealiter ontleden weefsel van het dier onmiddellijk vóór gebruik en is rechtstreeks plaats into PSS. OPMERKING: Sommige weefsels kunnen worden opgeslagen in de PSS overnacht bij 4 ° C, maar passende controles moeten worden uitgevoerd om weefsel functie na langdurige opslag te valideren; zie hoofdstuk 6. Gebruik de thoracale aorta als het weefsel in deze oefening. Verdoven van de rat in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en plaats de rat dorsale zijde naar beneden. Bevestig verdoving via een teen-snuifje en het verlies van de reflex reactie op deze pijnlijke stimulus. Opmerking: In dit protocol wordt 70 mg / kg pentobarbital geleverd via een intraperitoneale injectie. Institutionele richtlijnen voor knaagdieren anesthesie kunnen verschillen. Een pneumothorax Door een incisie met een schaar langs de membraan aan de onderkant van de ribbenkast. Vervolgens blijven de incisie van de onderkant van de ribbenkast naar het borstbeen en halveren. Ontleden weg of plaats opzij die organen die op de top van de wervelkolom en zoek de aorta, die direct langs de wervelkolom ligt. OPMERKING: Deze sTEP zorgt voor een duidelijke werkruimte te ontleden uit de aorta. Sever alle aansluitingen aan de aorta; van de slokdarm, long, etc. en snijd de aorta loodrecht op de ruggengraat ter hoogte van het membraan. Zachtjes houd de aorta met een pincet en gebruik een schaar om de aorta ontleden van de wervelkolom. Start de dissectie in het onderste membraan gebied grenzend aan de wervelkolom en werken in de richting van het hart. Zorg ervoor dat u extra voorzorgsmaatregelen om niet trekken of sleepboot te nemen over de aorta weefsel, dat het weefsel kunnen beschadigen. Plaats onmiddellijk de aorta in de voorbereide dissectie schotel met PSS. OPMERKING: Dissectie van de aorta in ringen gebeurt best in een dissectie gerecht dat een zwarte silastische stichting heeft. Dit maakt het gebruik van draden die kunnen gebruikt worden om de aorta canule en worden bevestigd aan de schotel, die stabiliteit terwijl de dissectie schotel. De zwarte achtergrond geeft contrast dat dissectie helpt. Zorg moeten worden genomen bij het gebruik van cannulating draden als de endothelial cellaag kunnen worden verwijderd met overmaat wrijven van de draad tegen het lumen van het vat. Neem een ​​draad en een kleine hoek van 90 ° aan de ene kant en duw het schuine uiteinde in de silastische stichting om de voerdraad te verankeren. Plaats het gehele aorta in de dissectie schotel. Houd het uiteinde van de geleidedraad met een pincet en dan zachtjes draad de draad in het lumen van de aorta. Gebruik een tang en schuif de aorta op de draad. Bij het vrije uiteinde van de geleidingsdraad is zichtbaar, curve de draad voorzichtig en plaats het vrije uiteinde in de silastic basis van de schotel naar het weefsel te stabiliseren. Met behulp van kleine Vannas schaar en pincet, verwijder de perivasculair vetweefsel en alle andere vreemde weefsel, bloedstolsels, enz. Tot de thoracale aorta lijkt wit en enigszins vezelig. Verwijder de gereinigde aorta van draad en met een schaar om de aorta ringen die ongeveer 3-5 mm breed gesneden. Een aorta-ring op één van een paar tissue haken door het vasthouden van de haak en met behulp van een tang om schuif de ring op de haak. Herhaal dit proces met de tweede haak. Let erop de haken niet verward; zie figuur 3. Controleer dat elke haak heeft een andere zijden hechtdraad bevestigd. Controleer dat één haak een kleine geknoopte lus van zijde die zorgt voor bevestiging aan een glas of roestvrij stalen staaf, terwijl de andere is een 04/10 cm lang stuk hechtdraad die hand gebonden aan de krachtopnemer zijn; zie figuur 3. Opmerking: Als de aorta is bevestigd aan de haken, het weefsel gereed in het weefselbad te monteren; zie figuur 3. Herhaal de stappen 2,14-2,15, om een ​​tweede aorta ring monteren in de tweede weefsel bad kamer. 3. Tissue Plaatsing in Bath Merk op dat in dit systeem de weefselbaden zelf stationair. Op dit moment, vult het weefsel baden met warm, cellenbeton PSS en laat de oplossing te komen om temperature. Met de zijden hechtdraad, das een van de haken op het weefsel voorbereiding op de pen op het roestvast stalen staaf. Plaats dit uiteinde in het weefsel bad kamer. Sluit de stang om een ​​ring stand en plaats het andere uiteinde in de kleuring schotel gevuld met PSS om weefsel ondergedompeld in buffer te houden; zie figuur 3. Plaats de staaf en weefsel in het weefsel bad kamer en zorg ervoor dat het weefsel wordt volledig ondergedompeld in PSS en de stang is veilig; zie figuur 3. Bind de andere hechtdraad aan de krachtopnemer en zorg ervoor om speling in de hechting tussen het weefsel en de krachtopnemer. LET OP: Deze speling wordt verwijderd door het aanpassen van de micrometer; zie figuur 3. Herhaal deze stappen voor de tweede aorta ring en weefsel bad kamer. 4. Instellen Passief Tension OPMERKING: Elk weefsel heeft een lengte (Lo) waarop gladde spiercellen reageren optimally. Voorlopige experimenten de optimale strekspanning die bereikt deze lengte voor elk weefseltype verplicht zodat onderzocht bepalen. De rat thoracale aorta heeft een optimale passieve strekspanning van 4 g. Gebruik de micrometer / tandheugel om de spanning te verhogen tot 2 g en wacht tot het weefsel naar een plateau te bereiken. Zodra plateau is bereikt, verhogen de spanning nog 2 g en wacht tot het weefsel naar een plateau. Opmerking: In de aorta ringen na de aanvankelijke spanning van 2 g werd ingesteld en plateau bereikt, het weefsel moet vervolgens ontspannen tot ~ 1,6 g. Een tweede toepassing van 2 g weefsel zou brengen ~ 3,6 g, waarvan het weefsel weer ontspannen en spanning afnemen. Dus na 4 g totale spanning te hebben toegevoegd, de software moet ongeveer 3,2 g van spanning geven. Herhaal deze stappen voor de tweede aorta ring en weefsel bad kamer. 5. Equilibratie and Drug Maken Equilibreer het weefsel voor60 min na het aanbrengen passieve spanning op het weefsel. Tijdens de evenwichtsfase, was het weefsel elke 15-20 min. Giet de weefsels bad en vervang de PSS met PSS uit een verwarmd reservoir. OPMERKING: Gedurende deze tijd, wordt het weefsel ontspannen, hetgeen wordt aangegeven door het verlies van passieve spanning. Gedurende deze tijd bereiden geneesmiddelen voor de proef, die moeten ten minste 1000 maal meer geconcentreerd dan de werkelijke concentratie in het bad te zijn, zodat slechts een kleine hoeveelheid van het geneesmiddel voorraad nodig is om de gewenste concentratie te bereiken. 6. Eerste Challenge Aan het einde van de evenwichtsperiode, was het weefsel een laatste keer, opslaan en opnieuw nul alle ingangen. Pick een agonist (verbinding die actieve contractie veroorzaakt) waarop het weefsel reageert. Opmerking: In de ratten thoracale aorta, de arteriële gladde spier actief samentrekken om een ​​alfa-adrenerge receptor agonist door de innervatie van deweefsel door het sympathische zenuwstelsel. Een adrenerge agonist zou niet nuttig zijn in darmweefsel te zijn gezien het feit dat adrenerge agonisten veroorzaken ontspanning. In dit geval wordt een receptor agonist zoals acetylcholine (cholinerge receptor) worden gebruikt. Een alternatief voor Fenylefrine en acetylcholine is een niet-receptor-agonist zoals hoge kalium (K) als de eerste uitdaging. In de gladde spieren, hoge K werkt om indirect geopend calciumkanalen en dus wordt gezien als een algemene index van de gladde spieren integriteit. Voer de eerste uitdaging of de wake-up challenge door het toevoegen van 10 -5 M fenylefrine aan het weefsel bad. Om deze concentratie in 50 ml weefselbad bereiken, voeg 50 ul van een 10 -2 M fenylefrine oplossing. OPMERKING: 50 pi in 50 ml PSS is een 1/1000 verdunning, zodat de uiteindelijke concentratie 1000x dan beelden, of 10 -5 M. Kennis van volume en consistente handhaving van het volume binnen het weefselbad chamber is van cruciaal belang voor het bepalen van de uiteindelijke concentratie van het geneesmiddel. Voeg 10 -5 M fenylefrine aan het weefselbad en laat de contractie piek en plateau, wanneer de helling van nul wordt. Zorg ervoor dat elke experimentele evenement aan post-experimentele analyse te helpen vast te leggen. Na het plateau, was de agonist grondig door het legen en opnieuw vullen van de weefsel bad kamer met nieuwe PSS. Zorg ervoor dat deze gebeurtenissen vast te leggen ook. OPMERKING: Een vuistregel is dat de concentratie van agonist in het bad wordt verminderd 10 maal met elke wasbeurt. Hoewel, kan meer dan 3-4 wassingen nodig zijn om het weefsel terug naar het evenwicht basislijn signaal (spanning) brengen. Laten we voor ~ 10 min voordat u verder gaat de rest weefsel bij baseline toon. 7. Experiment OPMERKING: Prazosin, een alfa adrenergische receptor antagonist, worden ingevoerd om het weefselbad kamer naar de concentratie resp verschuivenonse bocht naar fenylefrine (PE); dit is een aantoonbaar antagonisme. Om één bad, voeg het voertuig (H 2 O) waarin prazosine werd ontbonden. Naar de andere, voeg de juiste concentratie van prazosine. In dit geval, voeg 25 ul voertuig een bad en 25 ui 10 -5 M concentratie van prazosine voor de andere een 5 x 10 -9 M of 5 nM concentratie in het bad bereiken. OPMERKING: Terwijl de toevoeging van het voertuig lijkt overbodig in dit voorbeeld, is het noodzakelijk om dit te doen wanneer andere voertuigen die potentieel vasoactieve zijn (bijvoorbeeld DMSO, ethanol, acetaat) hebben. Voeg de bijbehorende voertuig, zelfs als weinig bewijs bestaat voor het aan vasoactieve zijn. Verlaat het voertuig / prazosine in de baden en hoeft het weefsel niet wassen gedurende 1 uur. Terwijl weefsels equilibreren, bereiden meerdere concentraties van agonist (PE). Omvatten een breed bereik van concentraties van concentraties waarbij nog geen respons (bv </ Em> 10 -9 M PE) aan concentraties die de maximale respons (overtreffen bijvoorbeeld 10 -4 M PE). Aangezien de concentratie-respons curves zijn logaritmisch van aard, maken zes afzonderlijke voorraad oplossingen van PE (10 -6 -10 -1 M) via de seriële verdunningen van de 10 -1 M stockoplossing. Zorg ervoor dat het benodigde volume voor elke concentratie is iets groter dan driemaal het totale benodigde volume voor alle baden (dwz> 300 ul). Ga verder toevoegen van agonist, zoals beschreven in tabel 1. LET OP: Dit experiment zal een cumulatieve concentratie respons curve naar PE genereren; elke iteratie houdt rekening met de hoeveelheid stof reeds toegevoegd aan het bad. Toevoegingen gebeuren totdat ze niet meer te verhogen contractie, of de hele curve heeft plateaued. Voeg elke geneesmiddelconcentratie afzonderlijk totdat het weefsel is bereikt. Als er geen verandering optreedt, voeg de volgende concentratie in hetserie; zie tabel 2. OPMERKING: De timing van deze toevoegingen is afhankelijk van de agonist. Bijvoorbeeld, noradrenaline en fenylefrine samentrekking ontwikkelt zich snel, en moet plateau binnen enkele minuten. Daarentegen endotheline-1 contractie ontwikkelt zich langzaam en kunnen niet plateau voor bijna 45 min. Andere experimenten kan op het weefsel na de bouw van een kromme zoals deze, mits (1) de stof uitwasbaar; en (2) kan worden aangetoond dat het weefsel weer normaal contractiele gedrag en wordt niet beïnvloed door de vorige stimulatie. 8. Data Analyse Zorg ervoor om gegevens op te slaan onmiddellijk voorafgaand aan en na een interventie (bijv wakker of volledige curve). Vinden en stel het weefsel basislijn voor elk weefsel bad kamer / input kanaal, dat zal helpen bij data-analyse. Zodra de basislijn is ingesteld, vindt de maximale respons voor elke concentratie, en noteer de change van de uitgangswaarde. Achtereenvolgens door elk van de concentraties en noteer de basislijn. Grafiek van de resulterende gegevens. Doe dit in een grafische programma. OPMERKING: Graph Pad Prism is ontworpen voor farmacologen en is ideaal voor type experiment hier gepresenteerd.