מדידה של תפקוד של שריר חלק ברקמות מבודדות אמבט-היישומים למחקר פרמקולוגיה
Summary
This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.
Abstract
Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum – if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.
Introduction
המשמעת של פרמקולוגיה השתמשה במערכת האמבטיה רקמה המבודדת למעלה מ -150 שנה. צדדיות של מערכת זו אפשרה למדענים ברחבי העולם כדי לאפיין קולטנים והעברת אותות קולט, עם הידע הזה עומד בבסיס הטיפולים שטופלו מיליוני אנשים עם מחלות או הפרעות כגון יתר לחץ דם, אי ספיקת לב, סוכרת, מחלות במערכת העיכול, שלפוחית השתן הפרעות בתפקוד, אסטמה, ובליעה, לשם רק כמה. עד עצם היום הזה, האמבטיה הרקמה המבודדת נשארה פן חשוב של פיתוח תרופות ומחקר בסיסי, שכן היא מאפשרת לרקמות לתפקד כרקמה. בשיעור זה יופיטר, פרוטוקול רשמי משותף להפגין ניסוי חזותי ווירטואלי ניצול נתונים מניסוי מבודד רקמת אמבטיה המודד כיווץ איזומטרי, המאפשר אפיון רצפטור.
היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שרקמת חייםפונקציות nd בכללותה רקמה, עם תוצאה פיזיולוגית (כיווץ או הרפיה) שהוא רלוונטי לגוף. זה הוא סינתזה של צעדים (אינטראקציה תרופה-קולטן, הולכים אותות, דור שליח שני, שינוי ברגישות שריר חלק, ושינוי בתפקוד רקמות). בעוד שיטות אחרות מאפשרות לימוד של כל אחד משלבים הבאים (לדוגמא radioligand מחייב לזיקת סמים, מדידה של שליחים שני), טכניקת האמבטיה רקמה המבודדת מאפשרת אינטגרציה של כל 1 את הפעולות הבאות. יתרון נוסף הוא ששמירה על תפקוד רקמות מאפשרת חישוב של משתנים תרופתיים חשובים, כי הם יותר משמעותיים ברקמה לעומת הגדרה סלולרית; מדובר קרוב יותר לאופן שבו התרופות שנבדקו היו עובדות בגוף כולו.
Protocol
Representative Results
Discussion
מדידה של כוח איזומטרי ככלי מחקר היא בן למעלה מ -150 שנים, אבל היא ממשיכה להיות הטכניקה הטיפוסית לאפיון רצפטור ברקמות התכווצות 2. כוחה של טכניקה זו הוא בפשטות וברבגוניות שלו: על ידי הקלטת תגובות שהושרו על ידי הגדלת ריכוזים של אגוניסט בנוכחותו או היעדריו של יריבו, מספר עצום של מידע ניתן לגזור על המאפיינים תרופתיים של כל תרופה והקולט ש הוא נקשר 3-5. ניסויים מסוג זה גם לגייס מידע על התחרותי מול הטבע הלא תחרותי של היריבים משמשים, כמו גם ההטרוגניות קולט והשפעות תרופה שאינן ספציפיות 6-8. לפיכך, עם תמורות פשוטות לניסוי אמבטיה רקמה מבודד זה, פרופיל תרופתי יחסית מלא של קולטנים אשר מתווכים התכווצות שרירים הנגרם אגוניסט יכול להיות שנוצר.
במונחים של agonism, הניתן לחשב דואר יעילות היחסית (E MAX) ועצמה (50 EC) של אגוניסט ברקמות נתון ובהשוואה לתגובות של אגוניסטים אחרים באותו הרקמה 1. בניסוי שלנו, אב העורקים החזי העכברוש הודגרה גם עם רכב או prazosin α אדרנרגיים 1 אנטגוניסט לרצפטור (5 ננומטר) במשך שעה אחת לפני הוספת phenylephrine אגוניסט אדרנרגי 1 α לאמבטיה הרקמה ויצירת התכווצות. איור 2 מתנות שונה תוצאות של איור 1. התגובות הירוקות סומנו בהתכווצות המרבית מושגת על ידי PE סומנו כמקסימום, ההתכווצות המרבית ½ מסומן ככאלה ולאחר מכן קשור עם ריכוז PE שגרמה שתגובה. זיהוי ערכים אלה הוא זיהוי הריכוז היעיל של אגוניסט שמשיג תגובת מחצית מקסימום (50%) או ערך EC 50.
למרבה הצער, שימוש בפרמטר אגוניסט תלויזה לבד כדי לקבוע יכול להיות מסובכים מאפיינים מחייבים קולט 9. באופן אידיאלי, ניסויים נוספים באמצעות יריבים הקולטן לאפשר החישוב של שני פרמטרים חשובים, כי הם מפתח להגדרת האינטראקציה בין תרופה וקולט: 10 -log של דיסוציאציה אנטגוניסט הקבועה (PK B) ו-log 10 של היריב טוחנת ריכוז דרוש כדי לעורר שינוי הכפול ימינה בעקומת ריכוז התגובה (PA 2) 10. שני K B והרשות פלסטיני 2 רווח התועלת שלהם מהעובדה שהם ערכי אגוניסט-עצמאי, ויישארו קבוע גם בין רקמות שונות 11. מהנתונים בתרשים 2, PK B יכול להיות מחושב באמצעות המשוואה הבאה ומבוסס על EC 50 ערכים מחושבים במקום אחר:
EC 50 בהעדר prazosin = 2 x 10 -8 M
EC 50 במראשהיגיון של prazosin = 7 x 10 -6 M
לפתור עבור K B במשוואה הבאה:
יומן (dr-1) = להיכנס [B] – יומן K B
איפה:
[B] = ריכוז antagonist, או 5 x 10 מ '-9 יומן (5 x 10 -9 M) = -8.3
dr = יחס מינון של ערך EC 50 בנוכחות של אנטגוניסט / 50 EC בהעדר. אם יש תזוזה ימינה, ערך זה יהיה גדול יותר מפעם אחת. כך:
dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M או 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
מחליף [B] וdr:
יומן (350-1) = -8 – יומן K B
2.54 = -8 – להיכנס KB
PK B = 10.54
ערך זה לprazosin עולה בקנה אחד עם הערכים שהתקבלו כאשר prazosin אינטראקציה עם recept adrenergic 1 αאו 12,13, דבר המצביע על כך שהקולטן adrenergic תיווך התכווצות לphenylephrine הוא קולטן adrenergic α 1.
כמה צעדים הם קריטיים להצלחה של ניסויים אלה. רקמות חייבת להישאר בPSS לאחר נתיחה כדי למנוע אובדן של כדאיות רקמות. יש כל הכנת השרירים איזומטרי יחסי אורך-מתח אופטימלי שיוצר כוח מקסימאלי נגד מתח פסיבי 14,15. לניסוי המתואר בפרוטוקול זה, מתח פסיבי אופטימלי נקבע בעבר על ידי מרווחי הוספה בקצרה של 0.5 גרם של מתח פסיבי לרקמות. הרקמה צריכה להתחיל בלי טון ואז אחרי 30 דקות של איזון, הרקמה אותגרה עם ריכוז מקסימאלי של KCl (80 מ"מ), שנוצר צליל פעיל. לאחר מכן, הרקמות נשטפו והורשו לחזור לטון בתחילת מחקר. אחרי 15 דקות בתחילת המחקר, 0.5 גר 'נוסף של מתח פסיבי הוצב והתהליך הזה שוב ושוב עד לרמה שלמתח פעיל הושג עם מתח פסיבי נוסף. בניסויים ראשוניים, 4 סך גרם של מתח הפסיבי היה נחוש להשיג דור מתח פעיל מקסימאלי בטבעות אב העורקים, ובכך סכום כולל זו של מתח מושם על הטבעות לפני האיזון. פרוצדורלית, עדיף להתמקד יישום מתח פסיבי לפני, אבל ניתן לעשות זאת בכל עת לפני הניסוי. המשתרע על פני-רקמות, בכל נקודה בניסוי או לנתיחה, תשפיע לרעה על כדאיות רקמות ותוצאות ניסוי. זה הכרחי ביותר בעת ביצוע רקמות באמבטיה, כצעד זה יש הסבירות הגבוהה ביותר של מתיחה מוגזמת. שטיפה נאותה, במספר ומשך נדרשת לאפקטים לשחזור. אתגר שני מוקדם מדי אחרי אתגר ראשוני, או לפני הרקמות חזרו למתח בסיסי, יגרום לתגובות חריגות. אם לומדים יריבים / מעכבים הפיכים, לא צריכים לשטוף רקמות לפני אגוניסט בנוסף, כinhibiריכוז טור יהיה ירידה.
ישנם יתרונות וחסרונות בולטים למבחני אמבטיה רקמות המבודדים.
חסרונות: רקמות עלולות להיתקל בדרגות שונות של נזק במהלך ניתוח להסרת או מיקום של טבעות על ווים. מאז התא האנדותל הוא הציפוי הפנימי של טבעת אב העורקים, יש להקפיד על המיקום של הטבעת על ווים, כדי שלא לפגוע בשכבת תאים זו. רקמות יכולות להיות גם באורכים שונים במובהק מהזמן שבו הם קיימא באמבטיה הרקמות, ואת זה יש שייקבע; לא כל הרקמות זהות. לאורך שורות אלה, רקמות עשויות להשתנות בהיענות שלהם לאורך כל היום כך שהבקרה בזמן הפכה לשליטה הנדרשת עבור כל ניסוי. דוגמא טובה לכך היא קנה הנשימה חזיר גינאה שמשפרת במקסימום התכווצות ב -100% במהלך ניסוי 8 שעות טיפוסיות. תרופות שהן מסיסים היטב במים עלולות לעורר בPSS. לבסוף, מצטברnd תוספות שאינן מצטברות של תרופה שהיא אגוניסט עלול לגרום לתוצאות שונות אם הפחתת רגישות הקולטן לאגוניסט מתרחשת; אנגיוטנסין II הוא תרופה אחת כזו שמראה tachyphylaxis המהיר.
יתרונות: אחד היתרונות העיקריים של ניסויי אמבטיה רקמה הוא שזה בזמן אמת; ניתן לראות את ניסוי עת התרחשותה ומהירות יכולה לעשות את המסקנות ולתכנן את הצעדים הבאים, כמו גם פתרון בעיות במהלך ניסוי. ניסוי לוקח יום לעשות. בדרך כלל ניתן להכין רקמות מרובות מחיה אחת כזאת שחיה יכולה לשמש כשליטה שלו, וזה מוסיף כוח לניסוי. אפשר גם לבודד את הרקמה מגורמים אחרים כדי לבחון את התגובה טהורה יחסית של הרקמה לתרופה. בניסויים במבחנה, כגון מערכת האמבטיה הרקמות מאפשרים גם שימוש בכמות קטנה של תרופה בהשוואה לניסוי in vivo.
עיצוב ניסיוני הבסיסי שתואר במסמך זה יכול להיותשינוי נרחב כדי לאפשר הקלטה של פרמטרים נוספים או ההקדמה של גירויים חיצוניים אחרים. לדוגמא, תוספת של אלקטרודות לאפשר לגירוי שדה חשמלי של עצבי innervating 16,17. עם התוספת של בדיקות תרמית או pH, ניתן גם למדוד את ההשפעות של טמפרטורה ו- pH על תגובות התכווצות 18,19. באופן דומה, חמצן ניתן להחליף באופן חלקי או במלואו עם N 2 כדי לבדוק את ההשפעות מושרה היפוקסיה. יתר על כן, אותם העקרונות הבסיסיים של מדידת התכווצות איזומטרי בשימוש בוידאו זה יכול לשמש לפיתוח מערכות המאפשרות מדידה במקביל לפיתוח מתח איזומטרי ושינויים בסידן תוך תאי 20. התמרה אות היא גם למדה בקלות, שכן מערכות קיימות שיכול במהירות להקפיא דגימת רקמה בתגובה, כך שהפעילות של מערכת מסלול העברת אותות ניתן לאמת ביוכימית.
הווריאציה של סוסיםipment שיכול לשמש כדי לעשות את זה הוא עצום. מערכת זו כולה, כל היד שנבנתה או אוטומטית, ניתן לרכוש מחברות שונות מרובות. אמבטיות הרקמה ובעלי רקמת שימוש בפרוטוקול זה היו מנופח ביד (אמבטיות רקמה) ויד שנבנתה (בעלים) על ידי מכונה חנויות אוניברסיטת מישיגן בבית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| LabChart Software | ADInstruments | 7.2 | |
| PowerLab (4 channel) | ADInstruments | ML760 | |
| QuadBridge (4 channel) | ADInstruments | ML112 | ML112 |
| Grass Adapter Cable | ADInstruments | MLAC11 | MLAC11 |
| Grass Force-Displacement Transducer | Grass Instrument Co | FT03 | FT03 |
| Grass Transducer Cable | Grass Instrument Co | TAC-7 REV-1 | |
| BNC to BNC Cable | ADInstruments | MLAC01 | |
| IsoTemp 2100 | Fisher Scientific | IC-2100 | |
| Tissue Bath | Multiple Sources | ||
| Physiological Salt Solution | PSS | ||
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Ring Stand | Humboldt MFG Co | H-2122 7 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Tygon Tubing | VWR Scientific | 63010-100 | R-3603 |
| Hose Clamps | Cole-Parmer Instrument Co | 06832-08 | SNP-8 |
| 50ml Muscle Bath | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| 250ml Warming Chambers | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| Gas Dispersion Tube | Ace Glass | 7202-06 | 7202-02 |
| Micrometer | |||
| Custom Stands | |||
| Three-Prong Clamps | VWR International | Talon | |
| S-Connector | VWR International | Talon | |
| Tissue Hooks | Hand Made in House | Custom | |
| Tissue Dissection | |||
| Leica Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | 12562-36 |
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | 160-150 |
| Splinter & Fixation Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | 160-55 |
References
- Kenakin, T. P. The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues. Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).
- Scheindlin, S. A brief history of modern pharmacology. Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).
- Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy. Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).
- Arunlakshana, O., Schild, H. O. Some quantitative uses of drug antagonists. Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).
- Christopoulos, A., Kenakin, T. G. protein-coupled receptor allosterism and complexing. Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).
- Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility. Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).
- Singh, J., et al. Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).
- Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression. J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).
- Colquhoun, D. Agonist-activated ion channels. Br. J. Pharmacol. 147, S17-26 (2006).
- Wyllie, D. J., Chen, P. E. Taking the time to study competitive antagonism. Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).
- Schild, H. O. pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947. Br. J. Pharmacol. 120 (4), 29-46 (1997).
- Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta. Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).
- Hiraoka, Y., et al. Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate. Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).
- Cooke, P. H., Fay, F. S. Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle. J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).
- Davis, M. J., Gore, R. W. Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles. Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).
- Davis, R. P., et al. One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat. ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).
- Heppner, T. J., et al. Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).
- Burdyga, T. V., Wray, S. On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle. J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).
- Hyvelin, J. M., O’Connor, C., McLoughlin, P. Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).
- Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava. Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).
