薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定

注：この論文で説明されているすべての手順は、ミシガン州立大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって確立されたガイドラインに従って実施されている。 1.システム準備とセットアップ 50ミリリットル組織浴に使い切る組織浴収縮実験に必要な量である生理食塩水（PSS）の5 Lを作る。 PSSレシピについては、表2を参照してください。組織浴時間風呂のボリュームの数を乗じた後、必要な組織洗浄の回数を掛けることによって、総必要容量を計算します。 PSSを作るためのガイドとして、表2を使用してください。水の約4リットルに塩を溶解。注：HPLC – タイプIの水が推奨されますエンド·ソリューションは、1.6 mMのカルシウムであるので、この溶液に（二水塩を使用している場合147グラム/ L）1 M CaCl 2溶液の8ミリリットルを追加します。 5 Lに量子sufficit PSS溶液</OL> 再循環加熱した水浴をオンにして37℃に組織浴システムを予熱する。重要なステップ：システムの各構成要素は、それらが互いに直列に接続されていることを確認し、水ジャケットである。流れの方向は非常に重要です – 水が最高有刺鉄線接続で最低の有刺鉄線の接続に出入り各コンポーネントに流れ込むことを確認してください。 データ収集システムの電源をオンにします。温度を平衡化するための実験の前に少なくとも力変換器の電源をオンにし、15分。 注：ほとんどの力変換器は、温度の変化に敏感である歪みゲージを採用し、電源投入後、最初に熱ドリフトを示す。 発射データ収集ソフトウェアおよびデータ収集システムとの接続を確保する。データの記録を可能にするための製造指示に従ってください。 力変換器は、組織が組織浴中に、データ記録が開始されたの前に配置される前に校正されていることを確認してください。 FOキャリブレーションのための製造業者の指示LLOW。 95％O 2/5％CO 2医療グレードのガスボンベに組織浴システムを接続し、ガス漏れをチェックしてから、システムを加圧する。 PSSで組織浴のリザーバを記入し、解析時間が最適な温度に到達することができます。プライムシステムとシステムとチューブ内の気泡を除去する。 PSSバッファを含酸素化合物と実験中に組織浴中に導入される薬を配布するためにブラウン運動を提供一貫性のあるソリューションの通気を確保するために組織浴エアレーターを確認してください。曝気/気泡がデータの記録が中断され、組織の動きを、発生しないことを確認してください。必要に応じてガス流を減少させる。 注：組織浴とデータ収集システムは現在、実験を開始する準備が整いました。 2.組織の準備理想的には、私を使用して直接配置する直前に動物からの組織を解剖PSS Ntoを。 注：一部の組織は、4℃で一晩PSSに保存することができますが、適切なコントロールは、長期保存後の組織機能を検証するために行われなければならない。第6節を参照してください。 この演習で組織として胸部大動脈を使用してください。 施設のガイドラインに従って、ラットを麻酔し、ラットの背側を下に置きます。つま先ピンチとこの痛みを伴う刺激に対する反射応答の損失を経由して麻酔を確認してください。 注：このプロトコルは、腹腔内注射によって送達ペントバルビタールの70 mg / kgをを使用しています。齧歯類麻酔のための制度のガイドラインが異なる場合があります。 胸郭の下部にダイアフラムに沿ってハサミで切開を作成することにより、気胸を作成します。次に、胸骨に胸郭の底部から切開を継続し、二分。 離れて解剖や脊柱の上にあるそれらの臓器を脇に置き、脊柱に沿って直接位置する大動脈を、見つける。 注：このは、STEPは、大動脈を切開する明確な作業スペースを提供しています。 大動脈へのすべての接続を切断。食道、肺、などから、振動板のレベルで脊椎に垂直な大動脈を切った。 静かに鉗子で大動脈を保持し、背骨から大動脈を切開するはさみを使用しています。心臓に向かって背骨と仕事に隣接する下部振動板面積で解剖を開始します。組織が損傷することがあり大動脈組織、引っ張ったり綱引きしないように余分な予防策を取るようにしてください。 すぐにPSSを含む準備された解剖皿に大動脈を置く。 注：リングに大動脈の解剖が最高の黒シラスティック基盤を持って、解剖皿に行われます。これは、解剖皿内ながら安定性を提供し、大動脈にカニューレを挿入するために用いることができ、皿に固定されるワイヤの使用を可能にする。黒の背景には、解剖を補助するコントラストを提供します。ケアは、内皮としてカニュレーションのワイヤの使用に注意が必要ですIAL細胞層は血管の内腔に対するワイヤの過剰なラビングを用いて除去することができる。 ワイヤーを取り、一方の端に小さな90°の角度を作り、ガイドワイヤを固定するシラスティック基盤に角度付きの端を押してください。解剖皿に全体の大動脈を置きます。 ピンセットで、ガイドワイヤの端を持ち、ゆっくり大動脈の内腔にワイヤーを通します。 鉗子を使用して、ワイヤ上に大動脈をスライドさせます。ガイドワイヤの自由端を穏やかに湾曲ワイヤ、表示され、組織を安定化するために皿のシラスティックファンデーションに自由端を配置する。 胸部大動脈は、白とやや繊維質表示されるまで、小さなvannasハサミやピンセットを使用して、血管周囲脂肪組織および他のすべての余分な組織、血の塊などを削除します。 ワイヤからきれいに大動脈を取り出し、幅約3〜5ミリメ​​ートルである環中の大動脈をカットするはさみを使用しています。 tiの対の一方に大動脈輪を配置フックを保持し、静かにフックの上にリングをスライドさせる鉗子を使用して、ssueフック。第2フックと、このプロセスを繰り返します。フックがもつれないように注意してください。 図3を参照してください。 各フックは付属の異なる絹縫合糸を持っていることを確認してください。他は手で結ば力変換器になります10〜4センチメートルロングピース縫合糸である、一方のフックは、ガラスやステンレス製の棒への取り付けが可能に絹の小さな結び目ループを持っていることを確認してください。 図3を参照してください。 NOTE：大動脈をフックに固定されると、組織は組織浴に装着する準備ができている。 図3を参照してください。 繰り返しは、第二組織浴室において第二大動脈リングをマウントするために、2.14から2.15繰り返します。 バースの3組織の配置このシステムでは、組織浴自体が静止していることに注意してください。この時、温め、曝気PSSで組織浴を記入し、溶液がtemperaturに来てできるようにするE。 絹縫合糸で、ステンレス鋼ロッドにペグに組織標本上のフックの1つを結びつける。組織浴室にこのエンドを置きます。リングスタンドにロッドを接続し、バッファに浸漬組織を維持するために、PSSで満たされた染色皿の中もう一方の端を置く。 図3を参照してください。 組織浴室においてロッドと組織を置き、組織が完全にPSSに浸漬され、ロッドが安全であることを確認してください。 図3を参照してください。 力変換器に他の縫合糸を結ぶと組織と力変換器との間に縫合糸のたるみを残すようにしてください。 注：このたるみは、マイクロメータを調整することにより、削除されます。 図3を参照してください。 第二大動脈リングと組織浴室のためのこれらの手順を繰り返します。 4.パッシブテンションを設定する注：各組織は、平滑筋細胞は最適値に応答する時の長さ（ロー）を有するLLY。予備実験は、個々の組織タイプのために実行する必要があり、この長さは、検査されるべき実現する最適な延伸張力を決定する。ラット胸部大動脈は4グラムの最適な受動的なストレッチのテンションを持っています。 2グラムに張力を高め、プラトーに到達するために組織を待つためにマイクロメータ/ラック＆ピニオンを使用してください。高原に達すると、テンションに別の2グラムを高め、高原に組織を待つ。 注：2グラムの初期張力が設定され、プラトーに達した後、大動脈輪では、組織はその後〜1.6グラムに緩和すべきである。 2グラムの第2の適用は、組織が再びリラックスし、緊張が低下しているから〜3.6グラム、に組織をもたらすだろう。従って、トータルテンションを4g加えた後、ソフトウェアは、張力の約3.2グラムを示すべきである。 第二大動脈リングと組織浴室のためのこれらの手順を繰り返します。 5.平衡医薬品メイキングのための組織を平衡化する組織への受動的な張力を付与した後60分。 平衡相の間に、組織ごとに15〜20分洗浄する。組織槽を排出し、温め容器からPSSにPSSを交換してください。 注：この時間の間に、組織は、受動的な緊張の喪失によって示されている、リラックスします。 この時間の間、そのように薬剤ストックのごく容積が所望の濃度を達成するために必要とされ、浴中の実際の濃度よりも少なくとも1,000倍より濃縮する必要が実験のための薬剤を調製する。 6.最初のチャレンジ平衡期間の終わりに、組織を最後に1回洗浄し、データを保存し、再ゼロすべての入力。 組織が応答する（アクティブ収縮の原因となる化合物）アゴニストを選択してください。 注：ラット胸部大動脈では、動脈平滑筋を積極的に原因の神経支配にαアドレナリン受容体作動薬に収縮する交感神経系による組織。アドレナリン作動薬は、アドレナリン作動薬が弛緩を引き起こすことを考えると、腸組織において有用ではない。この場合には、アセチルコリン（コリン作動性受容体）などの受容体アゴニストを使用することができる。フェニレフリンおよびアセチルコリン両方の代替は、第1のチャレンジなどの高カリウム（K）などの非受容体アゴニストを使用することである。平滑筋では、高K間接的オープンカルシウムチャネルに動作し、したがって、平滑筋の完全性の一般的な指標と見なされる。 組織浴に10 -5 Mのフェニレフリンを追加することによって、最初の課題やウェイクアップ挑戦を実行します。 50ミリリットルの組織浴にこの濃度を達成するために、10 -2 Mのフェニレフリン溶液50μlを加える。 注：PSSの50ミリリットルに50μlを1 / 1,000に希釈され、最終的な濃度が1,000倍株式未満、または10 -5 Mである組織浴C内のボリュームとボリュームの一貫性の維持管理の知識hamberは、最終薬物濃度を決定するために重要である。 データの勾配がゼロになったときに、組織浴に10 -5 Mのフェニレフリンを追加し、ピーク収縮を可能にし、その後プラトー。ポスト実験解析を支援するために、各実験イベントを記録するようにしてください。 高原の後、新しいPSSと組織浴室を空にして再充填することによって徹底的に作動薬を洗い流す。同様にこれらのイベントを記録するようにしてください。 注：経験則は、浴中のアゴニストの濃度は、各洗浄で10倍に減少することである。なお、以上の3〜4回の洗浄が戻ってダウンしてその平衡ベースライントーン（テンション）に組織を持参する必要があるかもしれない。 先に進む前に〜10分間のベースラインのトーンでの組織残りをしましょう​​。 7.実験 NOTE：プラゾシン、αアドレナリン受容体アンタゴニストは、濃度応答受信シフトする組織浴室に導入されるオンセ曲線フェニレフリン（PE）へ。これは明白な拮抗作用である。 1バスに、プラゾシンを溶解したビヒクル（H 2 O）を添加する。別に、プラゾシンの適切な濃度を追加します。この例では、5×10 -9 Mまたはバスで5 nMの濃度を達成するために、他に1バス、プラゾシンの10 -5 Mの濃度の25μlに車両の25μlを添加する。 注記：車両の添加は、この例では、不要と思われる一方で血管作用である可能性がある他の車両使用時に、そうすることが必須である（ 例えば、DMSO、エタノール、酢酸塩）。それは血管作動性であるために少し証拠が存在する場合でも対応する車両を追加します。 浴中の車両/プラゾシンのままにして、1時間のために組織を洗っていません。 組織が平衡化されていますが、作動薬（PE）の複数の濃度を準備。 例えば、<応答を誘発しない濃度（より広い範囲の濃度を含む/ em>の10 -9 M PE）最大応答（ 例えば、10 -4 M PE）を上回る濃度に。濃度-応答曲線は自然対数であるため、10 -1 Mのストック溶液から連続希釈を介してPE（10 -6〜10 -1 M）の6つの別々のストック溶液を作る。各濃度のために必要なボリュームがすべて風呂（ すなわち > 300μl）をするために必要なトリプル総量よりも若干大きくなっていることを確認します。 表1に記載されるように、作動薬の追加に進みます。 注：この実験は、PEに累積濃度応答曲線を生成します。各反復は、物質の量は、既に浴に添加考慮する。彼らはもはや収縮を増やす、または全体の曲線がプラトーするまで追加は発生しません。 組織のしきい値に達するまで、個別に各薬物濃度を追加する。 変化が発生しない場合、次の濃度を追加シリーズ; 表2を参照してください。 注：これらの追加のタイミングが使用される作動薬に依存します。例えば、ノルエピネフリンおよびフェニレフリン収縮が急速に発達し、数分以内にプラトー必要があります。これとは対照的に、エンドセリン-1収縮はゆっくり開発し、近くに45分間プラトーない場合があります。他の実験限り、このような曲線の構築後の組織で行うことができる（1）物質の洗浄うち。 （2）それは、組織が正常な収縮挙動に戻り、以前の刺激に影響されないことを実証することができる。 8.データ解析前と介入後すぐにデータを保存してください（ 例えば、ウェイクアップまたはフル曲線）。 検索してデータ分析を支援する各組織浴室/入力チャネル、のための組織ベースラインを設定。 ベースラインが設定されると、各濃度について最大応答を見つけ、ちゃんを記録ベースラインからのGE。順次濃度のそれぞれを通って移動し、ベースラインシフトを記録。 得られたデータをグラフ。すべてのグラフのプログラムでこれを行います。 注：グラフパッドプリズムは薬理学者のために設計され、これはここに提示され、実験のタイプに最適です。