La medición de la función del músculo liso en el tejido aislado Bath-aplicaciones en Farmacología Investigación

NOTA: Todos los procedimientos descritos en este documento se realizan de acuerdo con las directrices establecidas por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad Estatal de Michigan. 1. Preparación y configuración del sistema Hacer 5 L de una solución salina fisiológica (PSS), que es la cantidad necesaria para un experimento de contracción baño de tejido que utiliza hasta 50 ml baños de tejido; ver Tabla 2 para la receta PSS. Calcular el volumen total requerido por multiplicar el número de baños de tejido veces el volumen del baño y luego multiplicando por el número de lavados de tejidos requeridos. Utilice la Tabla 2 como guía para hacer PSS. Disolver las sales en aproximadamente 4 L de agua. Se recomienda utilizar agua del Tipo I – HPLC: NOTA Añadir 8 ml de 1 M solución de CaCl2 (147 g / L si se utiliza la sal dihidrato) a la solución, por lo que la solución final es de calcio 1,6 mM. Solución de PSS Quantum sufficit a 5 L. </ol> Precalentar el sistema de baño de tejido a 37 ° C mediante la activación de la recirculación de baño de agua caliente. Paso Crítico: Cada componente del sistema es con camisa de agua, asegúrese de que están conectados en serie entre sí. La dirección del flujo es crítico – asegurarse de que los flujos de agua en cada componente en la conexión de púas más bajo y fuera en el más alto de conexión de púas. Encienda el sistema de adquisición de datos. Encienda los transductores de fuerza por lo menos 15 minutos antes del experimento se equilibre la temperatura. NOTA: La mayoría de los transductores de fuerza emplean medidores de tensión que son sensibles a las variaciones de temperatura y exhiben deriva térmica inicialmente después de activar el detector. Lanzamiento software de adquisición de datos y garantizar la conexión con el sistema de adquisición de datos. Por favor, siga las instrucciones del fabricante para permitir la grabación de datos. Asegúrese de que los transductores de fuerza están calibrados antes de tejido se coloca en el baño de tejido y antes de la grabación de datos se ha iniciado; folas instrucciones del fabricante llow para la calibración. Conecte el sistema de baño de tejido a un 95% de O2 / 5% de CO 2 cilindro de gas de uso médico y verificar que no haya fugas de gas y luego presurizar el sistema. Llene los depósitos de baño tejidos con PSS y deje que el tiempo de solución alcance la temperatura óptima. Cebe el sistema y eliminar las burbujas de aire dentro del sistema y la tubería. Compruebe aireadores de baño tejido para asegurar la aireación solución coherente, que oxigena el buffer PSS y proporciona movimiento browniano para distribuir drogas que se introducirán en el baño de tejidos durante el experimento. Asegúrese de aireación / burbujas no causa el movimiento del tejido, lo que perturbará grabaciones de datos; disminuir el flujo de gas como sea necesario. NOTA: El baño de tejidos y el sistema de adquisición de datos ya están listos para iniciar el experimento. 2. Preparación del tejido Idealmente, diseccionar los tejidos del animal inmediatamente antes de su uso y colocarla directamente into PSS. NOTA: Algunos tejidos se pueden guardar en PSS noche a 4 ° C, pero los controles adecuados deben realizarse para validar la función del tejido después de un almacenamiento prolongado; véase la Sección 6. Utilice la aorta torácica como el tejido en este ejercicio. Anestesiar la rata de conformidad con las directrices institucionales y coloque la cara dorsal de la rata hacia abajo. Confirme anestesia a través de un dedo del pie-pinch y la pérdida de la respuesta refleja a este estímulo doloroso. NOTA: Este protocolo utiliza 70 mg / kg de pentobarbital entregado a través de una inyección intraperitoneal. Directrices institucionales para la anestesia de roedores pueden diferir. Crear un neumotórax mediante la creación de una incisión con unas tijeras a lo largo de la membrana en la parte inferior de la caja torácica. A continuación, continuar la incisión de la parte inferior de la caja torácica hasta el esternón y la bisectriz. Diseccionar o colocar a un lado aquellos órganos que están en la parte superior de la columna vertebral y localizar la aorta, que se encuentra directamente sobre la columna vertebral. NOTA: Este estep ofrece un espacio de trabajo claro para diseccionar la aorta. Sever todas las conexiones a la aorta; desde el esófago, pulmón, etc., y cortar la aorta perpendicular a la columna vertebral a nivel del diafragma. Aplique suavemente la aorta con unas pinzas y unas tijeras para diseccionar la aorta de la columna vertebral. Inicie la disección en la zona inferior del diafragma adyacente a la columna vertebral y el trabajo hacia el corazón. Asegúrese de tomar precauciones adicionales para no tirar o tirón en el tejido aórtico, lo que puede dañar el tejido. Coloque inmediatamente la aorta en el plato de la disección preparado que contiene PSS. NOTA: La disección de la aorta en anillos se realiza mejor en un plato de disección que tiene una base de silastic negro. Esto permite el uso de cables que se pueden utilizar para canular la aorta y ser fijado al plato, proporcionando estabilidad mientras que en el plato de la disección. El fondo negro proporciona un contraste que ayuda a la disección. Se debe tener cuidado en el uso de cables de canulación como la endothelcapa de células ial se puede quitar con un exceso de roce del hilo en contra de la luz del vaso. Tome un alambre y hacer un pequeño ángulo de 90 ° en un extremo y empuje el extremo en ángulo en la base de silastic para anclar el cable de guía. Colocar el total de la aorta en el plato de la disección. Mantenga el extremo del alambre guía con unas pinzas, y luego pase suavemente el cable en el lumen de la aorta. El uso de fórceps y deslice la aorta en el cable. Cuando el extremo libre del cable de guía es visible, curva el alambre suavemente y colocar el extremo libre en la base de silastic del plato para estabilizar el tejido. Utilizando Vannas pequeñas tijeras y pinzas, retire el tejido adiposo perivascular y todo otro tejido extraño, coágulos de sangre, etc., hasta la aorta torácica aparece en blanco y un poco fibrosa. Retire la aorta limpiado de alambre y utilizar tijeras para cortar la aorta en los anillos que son aproximadamente 3-5 mm de ancho. Publicar un anillo aórtico en uno de un par de tiganchos DICIÓN mediante la celebración de el gancho y el uso de fórceps para deslizar suavemente el anillo en el gancho. Repita este proceso con el segundo gancho. Tenga cuidado para asegurar los ganchos no enredar; véase la Figura 3. Compruebe que cada gancho tiene una sutura de seda diferente adjunto. Compruebe si un gancho tiene un pequeño lazo anudado de la seda que permite la unión a un vidrio o varillas de acero inoxidable, mientras que el otro es un 10-4 cm pieza larga de sutura que será para el transductor de fuerza atado a mano; véase la Figura 3. NOTA: Una vez que la aorta se fija a los ganchos, el tejido está listo para ser montado en el baño de tejido; véase la Figura 3. Repetir los pasos 2.14 a 2.15, para montar un segundo anillo aórtico en la segunda cámara de baño de tejido. 3. Colocación del tejido en el baño Tenga en cuenta que en este sistema, los propios baños de tejido son estacionarias. En este momento, llenar los baños de tejido con calentado, PSS aireado y permitir que la solución para llegar a la temperatura:e. Con la sutura de seda, ate uno de los ganchos en la preparación del tejido a la clavija en la varilla de acero inoxidable. Coloque este extremo en la cámara de baño de tejido. Conecte la varilla a un soporte universal y coloque el otro extremo en la cubeta de tinción llena con PSS para mantener el tejido sumergido en tampón; véase la Figura 3. Colocar la varilla y el tejido en la cámara de baño de tejido y asegurarse de que el tejido esté totalmente inmerso en PSS y la varilla es seguro; véase la Figura 3. Ate el otro sutura para el transductor de fuerza y ​​asegúrese de dejar holgura en la sutura entre el tejido y el transductor de fuerza. NOTA: Este holgura será eliminado ajustando el micrómetro; véase la Figura 3. Repita estos pasos para la segunda cámara anular y baño de tejido aórtico. 4. Ajuste de la tensión pasiva NOTA: Cada tejido tiene una longitud (Lo) en el que las células musculares lisas responden optimally. Los experimentos preliminares para determinar la tensión de estiramiento óptima que logra esta longitud se debe realizar para cada tipo de tejido individuo para ser examinado. La aorta torácica de rata tiene una tensión de estiramiento pasiva óptima de 4 g. Utilice el micrómetro / piñón y cremallera para aumentar la tensión de 2 g y esperar a que el tejido para llegar a la meseta. Una vez que se alcanza la meseta, aumentar la tensión otro 2 g y esperar a que el tejido a la meseta. NOTA: En los anillos de aorta, después de la tensión inicial de 2 g se ha puesto y meseta alcanzado, el tejido debe luego relajarse a ~ 1,6 g. Una segunda aplicación de 2 g traería el tejido a ~ 3,6 g, de la que el tejido se relaje de nuevo y la tensión disminuirá. Por lo tanto, después de haber añadido 4 g de la tensión total, el software debe indicar aproximadamente 3,2 g de tensión. Repita estos pasos para la segunda cámara anular y baño de tejido aórtico. 5. Equilibrio y Toma de Drogas Equilibrar el tejido durante60 min después de la aplicación de la tensión pasiva al tejido. Durante la fase de equilibrio, lavar el tejido cada 15-20 min. Vaciar el baño de tejidos y reemplazar el PSS con PSS de un depósito calentado. NOTA: Durante este tiempo, el tejido se relajará, que se indica por la pérdida de la tensión pasiva. Durante este tiempo, preparar medicamentos para el experimento, que deben ser de al menos 1.000 veces más concentrada que la concentración real en el baño, por lo que sólo se necesita un pequeño volumen de la madre de fármaco para conseguir la concentración deseada. 6. Desafío inicial Al final del período de equilibrio, lavar el tejido por última vez, guardar los datos y volver a cero todas las entradas. Elija un agonista (compuesto que provocará la contracción activa) a la que el tejido responde. NOTA: En la aorta torácica de rata, el músculo liso arterial se contraerá activamente a un agonista de los receptores adrenérgicos alfa debido a la inervación de latejido por el sistema nervioso simpático. Un agonista adrenérgico no sería útil en los tejidos intestinales dado que los agonistas adrenérgicos provocan la relajación. En este caso, un agonista de los receptores tales como acetilcolina (receptor colinérgico) podría ser utilizado. Una alternativa a tanto la fenilefrina y la acetilcolina es el uso de un agonista no receptor tales como niveles altos de potasio (K) como el primer desafío. En el músculo liso, de alta K opera para indirectamente los canales de calcio abierto y por lo tanto es visto como un índice general de la integridad del músculo liso. Realice el primer desafío o el reto de despertar por la adición de 10 -5 M fenilefrina al baño de tejido. Para alcanzar esta concentración en 50 ml de baño tejido, se añaden 50 l de una solución fenilefrina 10 -2 M. NOTA: 50 l en 50 ml de PSS es una dilución 1/1000, de modo que la concentración final es 1.000 x menos de la acción, o 10 -5 M. El conocimiento de volumen y mantenimiento constante del volumen dentro del baño de tejido cHamber es crítico para determinar la concentración de fármaco final. Añadir 10 -5 M fenilefrina al baño de tejido y permitir la contracción a pico y luego meseta, cuando la pendiente de los datos se convierte en cero. Asegúrese de registrar cada evento experimental para ayudar al análisis post-experimental. Después de meseta, lave el agonista a fondo por el vaciado y llenado de la cámara de baño de tejido con nuevo PSS. Asegúrese de registrar estos eventos también. NOTA: Una regla de oro es que la concentración de agonista en el baño se reduce 10 veces con cada lavado. Aunque, más de 3-4 lavados pueden ser necesarios para llevar el tejido hacia abajo a su tono de referencia de equilibrio (tensión). Que el resto del tejido en tono de línea de base para ~ 10 min antes de continuar. 7. Experimento NOTA: La prazosina, un antagonista del receptor adrenérgico alfa, será introducido a la cámara de baño de tejido para desplazar la resp concentracióncurva Onse a la fenilefrina (PE); este es un antagonismo demostrable. Para un baño, añadir el vehículo (H 2 O) en el que se disolvió la prazosina. A otro, añadir la concentración apropiada de prazosin. En este caso, añadir 25 l de vehículo para un baño y 25 l de 10 -5 M de concentración de prazosina a la otra para lograr una 5 x 10 -9 M o una concentración 5 nM en el baño. NOTA: Mientras que la adición de vehículo parece innecesaria en este ejemplo, es imperativo para hacerlo cuando se utilizan otros vehículos que tienen un potencial para ser vasoactivo (por ejemplo, DMSO, etanol, acetato). Añadir el vehículo correspondiente, incluso si existe poca evidencia de que sea vasoactivo. Deja vehículo / prazosina en los baños y no lavar el tejido durante 1 hora. Mientras que los tejidos se equilibrándose, preparar múltiples concentraciones de agonista (PE). Incluye una amplia gama de concentraciones, de las concentraciones que suscitan ninguna respuesta (por ejemplo, </ Em> 10 -9 M PE) a concentraciones que superan la respuesta máxima (por ejemplo, 10 -4 M PE). Desde curvas concentración-respuesta son logarítmicas en la naturaleza, hacer seis soluciones separadas de valores de PE (10 -6 -10 -1 M) a través de diluciones seriadas de la solución madre 10 -1 M. Asegúrese de que el volumen necesario para cada concentración es ligeramente mayor que el triple del volumen total necesario para todos los baños (es decir,> 300 mu l). Proceder a la adición de agonista, tal como se describe en la Tabla 1. NOTA: Este experimento generará una curva de respuesta a la concentración acumulada a PE; cada iteración tiene en cuenta la cantidad de sustancia ya añadida al baño. Las adiciones se producen hasta que ya no aumentan la contracción, o toda la curva se ha estabilizado. Añadir cada concentración de fármaco individualmente hasta que se alcanza el umbral de tejido. Si no se produce ningún cambio, añada la siguiente concentración en elserie; véase la Tabla 2. NOTA: El momento de estas adiciones depende del agonista utilizado. Por ejemplo, la noradrenalina y la contracción de la fenilefrina se desarrolla rápidamente, y deben estabilizarse en cuestión de minutos. Por el contrario, la endotelina-1 contracción se desarrolla lentamente y puede no estabilizarse por cerca de 45 minutos. Otros experimentación se puede hacer sobre el tejido después de la construcción de una curva como esta, siempre y cuando (1) la sustancia lavados fuera; y (2) se puede demostrar que el tejido vuelve a comportamiento normal contráctil y no se ve afectada por los estímulos previos. Análisis 8. Datos Asegúrese de guardar los datos inmediatamente antes y después de una intervención (por ejemplo, despertar o curva completa). Encuentra y establecer la línea de base de tejido para cada canal / cámara de entrada de baño de tejido, que ayudará en el análisis de datos. Una vez que la línea de base se establece, encontrar la respuesta máxima para cada concentración, y registrar el change de línea de base. Secuencialmente moverse a través de cada una de las concentraciones y registrar el cambio de línea de base. Grafica los datos resultantes. Haced esto en cualquier programa de gráficos. NOTA: Graph Pad Prism está diseñada para los farmacólogos, y esto es ideal para el tipo de experimento que aquí se presenta.