Один мышь, двух культур: Выделение и культивирование взрослых нервных стволовых клеток из двух Нейрогенные зон отдельных мышей

1. Основные настройки и подготовка питательной среды По крайней мере, за два дня до начала эксперимента, подготовить поли-D-лизин (PDL) / Ламинин покрытием пластин для прикрепленных культурах монослоя. Для подготовки скважин / колбы добавить достаточно PDL (10 мг / мл в дН 2 O) для покрытия поверхности и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре. Снимите решение от блюда и мыть блюду три раза по немецкой шкале 2 O. Дайте высохнуть на воздухе. Добавить ЛАМИНИНА (5 мг / мл в холодную DMEM: F12) и инкубировать при 37 ° С в течение ночи. Извлеките ламинин и либо сразу использовать или хранить пластины с ламинин при -20 ° С до использования. Подготовить стеклянные шлифованные пипетки с «средний» и «малых» отверстий, поворачивая стекло Пипетки Пастера в пламени, пока края не станут округлые. Автоклав для стерилизации. В день вскрытия, подготовить соответствующее количество культуральной среды путем смешивания Neural базальной среде с 2% B27, 1x глютамаксом, 2 мг / мл гепарина, 50 единиц / мл пенициллина / стрептомицина, 20 нг / мл очищенного фактора мышь рецептор класса роста эпидермиса (EGF) и 20 нг / мл рекомбинантного фактора бычьего роста фибробластов (FGF-2). Теплый культуральной среды до 37 ° С на водяной бане. Для SVZ диссоциации, готовят 0,05% трипсин-ЭДТА и 0,125 мг / мл ингибитора трипсина, содержащий 0,01 мг / мл DNAseI. Равновесие этих решений до 37 ° C. Настройка рассечение микроскоп и подготовить необходимые инструменты для удаления мозг (ножницы и малых шпатель) и СВЗ и DG вскрытий (скальпель, 27 G игла прикреплена к 1 мл шприц, 1 х # 7 щипцы, 1 х # 5/45 щипцы) путем замачивания в 70% этанола. 2. Заготовка Мозги взрослой мыши и СВЗ / DG Microdissections Обезболить один взрослый (8-недельных) мышей согласно соответствующим ведомственным руководящим принципам. Выполните шейки дислокации. Спрей голову с 70% этанола для стерилизации области и свести к минимуму количество меха, чтоdheres к ножницы и мозга. Использование острыми ножницами обезглавить животное у основания ствола мозга. Держа голову у основания черепа, разрезать череп между двумя обонятельных луковиц, помещая одно лезвие небольшого ножницами в каждой полости глаза и резки коронально. Далее, убедитесь, две боковые порезы в то основания черепа, после чего продольного разреза через череп вдоль стреловидного шва Внимание:. Обеспечения угол ножниц является как мелкой, чтобы избежать повреждения основной мозг. Expose мозг посредством отслаивания череп с любой лезвия ножниц или парой изогнутых щипцов. Освободите мозг от черепа с помощью небольшого шпателя и место в холодную PBS. Промыть мозги с PBS, чтобы удалить кровь и мех. Трансфер мозги в 10 см пластиковой чашке Петри, содержащей PBS Поместите чашку Петри, содержащую мозг при вскрытии микроскопом при малом увеличении и положение BRAIн на его вентральной поверхности. Использование тонких изогнутых щипцов удалить обонятельные луковицы, удерживая мозг в положении мозжечка. Поверните мозг на спинной части и с помощью скальпеля сделать корональной разрез через мозг на уровне зрительного перекреста Для microdissect СВЗ (для получения более подробных инструкций, см. также Азари и др.. 10), поместите ростральной части мозга, так что сократить корональной поверхность обращена вверх, а сфокусировать микроскоп на большем увеличении. Снимите и выбросьте перегородки с использованием тонких изогнутых щипцов. Рассеките SVZ (тонкий слой ткани, окружающей желудочек), немедленно помещая кончик одного лезвия парой тонких изогнутых щипцов в боковом углу бокового желудочка непосредственно под мозолистого тела и других примерно 1 мм в ткани примыкает к желудочка. Надавите щипцы к основанию блюдо и к вентральной части VENTRключицы, чтобы удалить небольшой треугольный кусок ткани. Поместите расчлененный SVZ в чашку Петри на льду. Для microdissect ГД (для получения более подробных инструкций, см. также Hagihara др.. 11), поместите хвостовой части мозга в чашке Петри и разрезать вдоль продольной трещины с помощью скальпеля. Под микроскопом рассечение, удалить мозжечок и промежуточного мозга с помощью щипцов. Перефокусируйте микроскоп, чтобы границы вокруг ГД теперь видны. Для удаления зубчатой ​​извилине, вставьте кончик иглы 27 G и слайд вдоль границы между ГД и рога Аммона. Используя тонкий пинцет, освободить DG от окружающей ткани. 3. СВЗ ткани Диссоциация Фарш ткани с использованием лезвие скальпеля в течение приблизительно 1 мин, пока никаких больших листа не остались. Передача фарш ткани на 15 мл пробирку с использованием 1 мл предварительно нагретого 0,05% трипсин-ЭДТА и инкубировали в течение 7 минут вводяная баня установлен на 37 ° С Чтобы остановить ферментативную реакцию, добавить 1 мл ингибитор трипсина, содержащим DNAseI и перемешать содержимое, щелкая трубки. Гранул подвеску центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант Ресуспендируют гранул в 1 мл среды роста и диссоциации, осторожно пипеткой вверх и вниз приблизительно 7-10X с использованием P1000 пипетки. Внимание: более перетирания может привести к увеличению гибели клеток и может негативно сказаться на последующем росте клеток. Добавить питательную среду до общего объема 5 мл и передать клеточной суспензии через 40-мм сито для удаления мусора и недиссоциированные сгустки ткани. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин, отбросить супернатант и ресуспендируют осадок в результате 200 мл среды роста. 4. Д.Г. ткани Диссоциация Фарш ткани с использованием лезвие скальпеля в течение приблизительно 1 мин, пока никаких больших листа не остались и передачав предварительно нагретом PDD смеси ферментов (папаин 2,5 ед / мл, диспаза 1 ед / мл, ДНКазой I 250 U / мл). Инкубировать в течение 20 мин при 37 ° С, перемешивание путем обращения трубки каждые 3-5 минут. Диссоциируют ткани механически, используя средний отверстие, огонь полированные, пипетки Пастера с помощью пипетки вверх и вниз, осторожно 10x. Инкубировать в течение еще 10 мин при 37 ° С, перемешивание путем обращения трубки каждые 3-5 минут. Далее отделить ткань механически с помощью небольшой отверстие, огонь полированные пипетки Пастера с помощью пипетки вверх и вниз, осторожно 10x. Центрифуга при 130 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл буфера раствором (1x HBSS, 30 мМ глюкозы, 2 мМ HEPES (рН 7,4), 26 мМ NaHCO 3). Сделать до 10 мл буферного раствора. Центрифуга при 130 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл 20% Percoll. (Чтобы приготовить 90% Перколла, добавьте 4,5 мл 100% Percoll в 0,5 мл 10х PBS затем дополнительно разбавить это до 20%добавлением 1,1 мл 90% Перколла в 3,9 мл 1x PBS). Центрифуга 450 мкг в течение 15 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл буфера. Центрифуга при 130 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют осадок в 200 мкл ростовой среды. 5. Генерация Приверженец однослойные культуры Plate Диссоциированные SVZ или DG ткани в единую PDL / ЛАМИНИНА покрытием лунку 96-луночного планшета и инкубировать при 37 ° С с 5% CO 2. Примерно 24 ч после посева, когда клетки присоединились к поверхности, покрытой, обмен питательную среду для дальнейшего удаления избытка мусора. Каждые последующие 3-4 дней, обмен половина питательной среды свежей средой для пополнения факторы роста. Повторяйте, пока клетки не достигнут примерно 80% слияния и готовы пассировать Примечание:. Промежуток времени между обшивкой и первого прохождения может занять до 2-3 недель. <pкласс = "jove_title"> 6. Пассажи Приверженец однослойные культуры Когда культур составит около 80% слияния удалить среды из скважины и промыть PBS. Примечание: Не позволяют клеткам превышать 90% слияния, так как это может привести к отрыву клеток и нейросфера образования и, кроме того, повышение уровня гибели клеток. Добавить 50 мл Accutase и инкубировать при 37 ° С в течение 2-3 мин (проверять, если клетки округлены и отдельный). Удаление клеток в 15 мл пробирку и промыть хорошо один раз ЗФР и передачи одной и той же трубе. Развести клеток в 5 мл с PBS и центрифугировать 300 мкг в течение 5 мин. Для первого прохода, разбавленных клеток в 1 мл и пластины в PDL / ламинин покрытием лунку 24-луночного планшета. Для последующих проходах, ресуспендирования клеток в 200 мл среды роста и подсчет с помощью гемоцитометра. Пластина в 1 х 10 4 клеток / см 2 в соответствующего размера с покрытием скважины или колбу. </l я> 7. Дифференциация Приверженец однослойные культуры Чтобы различать прилипшие культур монослоев, пластины пролиферирующих клеток на покровных стеклах PDL / ламинин покрытием с плотностью 1 × 10 4 клеток / см 2 в ростовой среде, содержащей 20 нг / мл EGF и 10 нг / мл BFGF. Когда клетки достигают примерно 80% слияния (обычно 2 дня), замените питательную среду средой, содержащей 5 нг / мл и оФРФ 0 нг / мл EGF. После 2 дней в 5 нг / мл оФРФ, замените носитель с ростовой среде в отсутствие обоих митогены еще в течение 3 дней. Примечание: в этот период значительное количество гибели клеток происходит. После в общей сложности 5 дней, мыть дифференцированных клеток с PBS, чтобы удалить любые мертвые клетки затем исправить с 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 мин при комнатной температуре. Вымойте снова PBS, чтобы удалить любые PFA и хранить покровные в скважинах в 1 мл PBS при 4 ° С. jove_title "> 8. нейросфера Культура и Количественное Развести диссоциированных SVZ или DG ткани от одного животного в 20 мл культуральной среды и пластины 200 мл / лунку через 96-луночного планшета с использованием 10 мл multidoser пипетки. Инкубировать при 37 ° C с 5% CO 2 в течение 6-7 дней для СВЗ-производных нейросферы и 10-12 дней для DG-производных нейросферы. Примечание: рост более чем на этих рекомендованного времени инкубации приведет к чрезмерно быстрый рост и приведет к гибели клеток в центре нейросферы и / или, спонтанной привязанности и дифференциации. Граф и измерить диаметр нейросферы помощью окуляра координатную сетку, установленный на вертикальном светового микроскопа 9. Пассажей нейросферы После первичного нейросферы были подсчитаны и записаны их размер, они могут быть расширены за несколько проходов начиная с любой одной или нейросфера объемной культуры. Массовая экспансия культуры нейросфера Для прохода в сочетании нейросферы как насыпной культуры, удалите среды, содержащей нейросферы из пластины, трансфер в 15 мл трубки и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют в нейросферы 1 мл предварительно нагретого 0,05% трипсин-ЭДТА и инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин. Добавить равный объем ингибитор трипсина, содержащим ДНКазой I и хорошо перемешать. Центрифуга течение 5 мин при 300 мкг в, удалите супернатант и добавить 1 мл ростовой среды. Растирают вверх и вниз приблизительно в 10 раз с P1000 пипетки для диссоциации нейросферы. Удалить 10 мл клеточной суспензии и смешать с равным объемом трипанового синего и выполнить живых клеток с помощью гемоцитометра. Повторное заполнение клеток при плотности 1 х 10 4 клеток / см 2 в соответствующей культуры клеток размера скважины или колбу. Инкубировать при 37 ° Cс 5% CO 2 до вторичные нейросферы форме. Одноместный расширение нейросфера Для прохождения отдельных нейросферы выбрать скважин, которые содержат один нейросфера и тщательно удалить и уничтожить около 160 мкл питательной среды из каждой лунки, не нарушая нейросфера. Добавить 100 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в каждую лунку в пассировать и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Добавьте 100 мкл ингибитора трипсина, содержащий DNAseI, чтобы остановить реакцию. Растирают примерно в 10 раз вверх и вниз с P200 пипетки Чтобы разбить нейросфера. Передача 200 мл, содержащие диссоциированных нейросфера к новому лунку 24-луночного планшета, содержащего 1,5 мл ростовой среды. Инкубируют при 37 ° С с 5% CO 2 до вторичные нейросферах форме. Примечание: для определения долгосрочного потенциала, один из кардинальных свойств истинного нейронных скамере ПЭК, нейросферы следует пассировать в течение не менее 5-10 проходов. См. также литературу по в части спорной интерпретации таких результатов 12-14. 10. Дифференциация нейросфера культур Первичные или пассированные нейросферы могут быть дифференцированы для определения multipotentiality. Удалить нейросферы в виде суспензии из питательных пластины или колба и перенести их на 10 см пластиковой чашке Петри. Под микроскопом рассечение удалить примерно 15-20 нейросферы из среды с помощью пипетки P20 и переносят в 24-луночный планшет, содержащий культуральную среду без факторов роста и покровным PDL / ламинин покрытием. Дифференцировать в течение примерно 7 дней при 37 ° С с 5% CO 2. Промыть дифференцированные нейросферы с PBS, чтобы удалить любые мертвые клетки затем исправить с 4% PFA в течение 20 мин при комнатной температуре. Вымойте снова PBS до галить любые PFA и хранить в покровные скважин в 1 мл PBS при 4 ° С 11. Иммуноокрашивание нейросфера и приверженцем культур Примечание: Для окрашивания антитела O4 опустить Тритон от блокирующих и окрашивания шагов и не забудьте использовать соответствующий IgM вторичного антитела. Инкубируйте покровные, содержащие дифференцированные нейросферы или прилипшие культур монослоев в блокирующем растворе (10% нормальный осел сыворотки в PBS, содержащем 0,2% Тритон Х-100) в течение 60 мин при комнатной температуре. Инкубировать в пресной блокирующего раствора, содержащего первичную BIII-тубулина, Map2a + В, глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) или O4 антитела в течение 60 мин при комнатной температуре. Вымойте 3x с PBS. Инкубировать в пресной блокирующего раствора, содержащего соответствующие флуоресцентные конъюгированные вторичные антитела и 4,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI; 1:5000) в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. <lI> Промыть три раза PBS. Установите покровные на предметных стеклах с помощью флуоресцентной монтажный среднего и сухой воздух в темной ночи Просмотр и изображения с помощью флуоресцентного микроскопа.