マウスを一回、二つの文化：個々のマウスの二つの神経原性のゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

1。基本的なセットアップと培養液の調製実験を開始する前に、少なくとも2日間、接着単層培養のためのポリ-D-リジン（PDL）/ラミニンでコーティングしたプレートを準備します。調製するウェル/フラスコを被覆する表面（のdH 2 O中の10 mg / ml）を十分なPDLを追加し、室温で一晩インキュベートする。皿から溶液を除去およびDH 2 Oでお皿を3回洗浄空気乾燥させます。ラミニン（冷DMEM中の5 mg / mlの：F12）を追加し、37℃で一晩インキュベートする。ラミニンを削除し、直ちにプレートを使用することも、必要になるまで-20℃でラミニンで保管してください。 エッジが丸くなるまで炎でガラスパスツールピペットを回転させることで「中」「小」の穴で火ポリッシュピペットを準備します。滅菌するオートクレーブ。 解剖の日に、2％B27、1×グルタ、2 mg / mlのヘパリンで神経基本培地を混合することにより、培地の適切な量を調製し、50単位/ mlペニシリン/ストレプトマイシン、20 ng / mlの精製マウスレセプターグレードの上皮成長因子（EGF）、および20 ng / mlの組換えウシ線維芽細胞増殖因子（FGF-2）。水浴中で37℃に培養液を温める。 SVZ解離のために、0.05％トリプシン-EDTAを調製し、0.125 mg / mlのトリプシン、0.01 mg / mlのDNアーゼ阻害剤を含有する。 37℃にこれらのソリューションを平衡化解剖顕微鏡を設定し、脳（はさみと小さなヘラ）を除去するために必要なツールを準備し、SVZとDG解剖（小刀、1ミリリットルのシリンジに取り付け、27G針、1×＃7鉗子、1 X＃5/45 70％エタノールに浸すことによって鉗子）。 2。大人のマウスの脳およびSVZ / DG Microdissectionsの収穫適切な施設のガイドラインに従って、単​​一の成人（8週齢）マウスを麻酔。頸椎脱臼を実行します。 領域を滅菌するために毛皮の量を最小限に抑えるために70％エタノールでスプレーヘッドことはさみや脳にdheres。鋭いハサミを使用すると、脳幹の基部に動物を首を切る。 頭蓋底のヘッドを保持して、それぞれの目の空洞の中にはさみの小さなペアの1のブレードを配置し、冠状に切断することにより、2嗅球の間頭蓋骨を切った。次に、矢状縫合に沿って頭蓋骨を通して縦カットに続いて頭蓋底、2つの横方向の切断を行う注意 ：ハサミの角度が、基礎となる脳の損傷を避けるために、可能な限り浅いことを確認してください。 ハサミの刃や湾曲したピンセットのいずれかでスカルをバック剥離することにより脳を公開します。冷PBSに小さなヘラと場所を使って頭蓋骨から脳を解放します。 血液や毛皮を除去するためにPBSで脳を洗浄します。 PBSを含有する10cmのプラスチック製ペトリ皿に脳を転送する低倍率での解剖顕微鏡下で脳を含むペトリ皿を置き、BRAIを位置決めその腹側表面上にn。小脳によって所定の位置に頭を押さえながら細かい曲線状の鉗子を使用すると、嗅球を除去します。 背側面上に脳を回転させて、メスを使用すると、視交叉のレベルで脳の冠状切断を行う SVZを顕微解剖する（より詳細な手順については、アザリら 10も参照のこと）、カット冠状面を上に向くように、脳の吻側部分を配置し、高倍率に顕微鏡の焦点を合わせる。削除して、細かい湾曲したピンセットを用いてセプタムを捨てる。 すぐに組織の中に、すぐに脳梁とその他が約1ミリメートルの下側脳室の左右の角にある細い曲線状ピンセットの1刃の先端を配置することによって、SVZ（心室の周囲の組織の薄い層）を解剖心室に隣接。お皿の底に向けてとventrの腹側面に向けた鉗子を押し下げるICLEは、組織の小さな三角形の部分を削除します。氷上のペトリ皿に解剖し、SVZを配置します。 DGを顕微解剖する（より詳細な手順については、萩原ら 11も参照）、ペトリ皿とメスを用いて縦方向の亀裂に沿って切断し、脳の尾の部分を置く。 解剖顕微鏡下では、小脳や鉗子を使用して間脳を削除します。 DGの周りの境界線が表示されるようになりましたように、顕微鏡に再び焦点を合わせる。歯状回を削除するには、DGとアンモン角の間の境界に沿って27のG針とスライドの先端を挿入します。細かい鉗子を使用して、周囲の組織からのDGを解放。 3。 SVZ組織解離大きな片がなくなるまで約1分間、手術用メスの刃を用いて組織をミンチ。 温めておいた0.05％トリプシン-EDTAの1ミリリットルを使用して15mlチューブにみじん切りの組織を移し、7分間インキュベート37℃に設定した水浴酵素反応を停止するには、DNアーゼIを含むトリプシンインヒビターの1ミリリットルを加え、チューブをフリックで内容物を混合。 5分間300×gで遠心分離することにより、サスペンションをペレットと上清を捨てる増殖培地の1ミリリットル中にペレットを再懸濁し、P1000ピペットを用いて静かにピペッティングを約7〜10倍で解離注意：粉砕する以上は、細胞死の増加につながることができ負その後の細胞の成長に影響を与えます。 5ミリリットルの全体積に増殖培地を追加し、デブリと非解離組織塊を除去するための40mmの篩を通して細胞懸濁液を渡す。 5分間300×gで遠心し、上清を廃棄し、200ミリリットルの増殖培地中で得られたペレットを懸濁します。 4。 DGの組織解離大きな片が残っていないと転送されるまで約1分間、手術用メスの刃を用いて組織をミンチ予め温めPDD酵素ミックス（パパイン2.5単位/ ml、ディスパーゼ1単位/ ml、DNアーゼI 250単位/ ml）に変換する。管ごとに3〜5分を反転することにより混合し、37℃で20分間インキュベートする。 機械的にそっと10倍をピペッティングによりミディアムボア、火災洗練された、パスツールピペットを用いて組織を解離する。 管ごとに3〜5分を反転することにより混合し、37℃でさらに10分間インキュベートする。 さらに、機械的に小さな穴を使用して、組織を解離、火はそっと10倍をピペッティングによりパスツールピペットを磨いた。 5分間130×gで遠心分離する。 上清を除去し、1ミリリットルの緩衝液（1×HBSS、30 mMのグルコース、2のHEPES（pH7.4）を、26 mMの炭酸水素ナトリウム）でペレットを再懸濁します。緩衝液で10mlに構成しています。 5分間130×gで遠心分離する。 上清を除去し、20％パーコール5mlにペレットを再懸濁します。 （その後さらに20パーセントにこれを希釈して10倍のPBS 0.5mlに100パーセントパーコールの4.5ミリリットルを加え、90％パーコールを製造するために、3.9ミリリットル1X PBS）に1.1ミリリットル90％パーコールを追加することによって。 15分間遠心450 XG。 上清を除去し、10ミリリットルのバッファーでペレットを再懸濁します。 5分間130×gで遠心分離する。 200μlの増殖培地中でペレットを再懸濁。 5。接着単層培養の生成 96ウェルプレートのウェルコーティングされた単一のPDL /ラミニンに解離SVZまたはDG組織をプレートし、5％CO 2、37℃でインキュベートする。 めっき後の約24時間後、細胞が被覆された表面に付着した後、さらに過剰な破片を除去する成長培地を交換する。 続く3〜4日ごとに、成長因子を補充する新鮮な培地で増殖培地の交換半。 メッキと第一通路との間の時間は2〜3週間ほどかかる場合があります。細胞が約80％の集密度に達し、継代する準備が整うまで、 注意してください繰り返します。 <pクラス= "jove_title"> 6。接着単層培養の継代培養物が約80％の集密度に達したときに井戸から培地を除去し、PBSで洗浄する。 注：これは、細胞の剥離およびニューロスフェアの形成につながり、さらに、細胞死のレベルを増加することができますように、細胞が90％の密集度を超えないようにしてください。 （細胞は丸みを帯びたと切り離されているかどうかをチェックする）50ミリリットルをAccutaseを追加し、2〜3分間37℃でインキュベートする。 15mlチューブに細胞を除去し、ウェルのPBSで一度洗い、同じチューブに移す。 PBSで5ミリリットルと5分間の遠心分離器300 XGに細胞を希釈する。 最初の通過のために、24ウェルプレートのウェルコーティングしたPDL /ラミニンに1ミリリットルとプレートに細胞を希釈する。 その後の継代のために、200ミリリットルの増殖培地と数の再懸濁細胞は血球計数器を用いて。適切なサイズのコートされたウェルまたはフラスコ中の1×10 4細胞/ cm 2でプレート。 </l I> 7。接着単層培養の分化 20 ng / mlのEGFおよび10 ng / mlのbFGFを含有増殖培地中1×10 4細胞/ cm 2の密度で、PDL /ラミニンコートしたカバーガラス上に接着単層培養物を、プレートに増殖している細胞を分化する。 細胞が約80％の密集度（通常は2日間）に達したときに、5 ng / mlのbFGFおよび0 ng / mLのEGFを含む培地で増殖培地を交換してください。 5 ng / mlのbFGFを2日後に、さらに3日間両方のマイトジェンの非存在下で増殖培地で培地を交換注 ：この期間に細胞死の有意な量が発生する。 5日間の合計した後、室温で20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、次いで任意死細胞を除去するためにPBSで分化した細胞を洗浄する。 4℃で1ミリリットルPBSにウェル内の任意のPFAや店舗カバーグラスを除去してPBSで再び洗浄しますjove_title "> 8。ニューロスフェアの文化と定量培養培地20ml中に一匹の動物から解離SVZまたはDG組織を希釈し、10ml multidoserピペットを用いて、96ウェルプレートにおける200ミリリットル/ウエルプレート。 DG由来のニューロスフェア用SVZ由来のニューロスフェア10〜12日間、6〜7日間で5％CO 2、37℃でインキュベートする。 注：これらの推奨インキュベーション時間よりも長い間成長が異常増殖をもたらすであろうし、ニューロスフェアおよび/ ​​または、自発的な愛着と分化の中心に細胞死につながる。 数え、直立光顕微鏡に装着した接眼目盛を使用してニューロスフェアの直径を測定 9。ニューロスフェアを継代一次ニューロスフェアをカウントされ、その大きさが記録された後、それらを単一の神経球またはバルク培養物のいずれかで始まるいくつかの継代にわたって拡張することができる。 バルク培養ニューロスフェアの展開 バルク文化としての通路を組み合わせニューロスフェアを、5分間300×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機に移し、プレートからニューロスフェアを含む培地を除去します。 上澄み液を捨て、あらかじめ温めておいた0.05％トリプシン-EDTA 1mlにニューロスフェアを再懸濁し、3分間室温でインキュベートする。 DNアーゼIを含むトリプシンインヒビターを等量加え、よく混ぜる。 300×gで5分間遠心、上清を除去し、増殖培地の1ミリリットルを加える。 ニューロスフェアを解離P1000ピペットで上下に約10倍粉砕する。 細胞懸濁液10ミリリットルを削除し、トリパンブルー等容量の混在血球計数器を用いて生菌数を実行します。 適切なサイズの細胞培養ウェルまたはフラスコ中の1×10 4細胞/ cm 2の密度で細胞を再シードする。 37℃でインキュベート5％のCO 2を有する二次ニューロスフェアが形成されるまで。 単一のニューロスフェアの展開 通路に個々の神経球は、単一のニューロスフェアを含むウェルを選択し、慎重にニューロスフェアを乱すことなく、各ウェルから増殖培地を約160μLを取り外し、廃棄します。 各ウェルに継代するために、0.05％トリプシン-EDTAの100ミリリットルを加え、3分間室温でインキュベートする。 反応を停止させるのDNAseIを含む阻害剤トリプシンを100μlを加える。 上下にP200ピペットを用いて粉末化し、約10倍のニューロスフェアをバラバラにする。 増殖培地1.5 mlを含む24ウェルプレートの新しいウェルに解離したニューロスフェアを含有する200ミリリットルを転送する。二次ニューロスフェアが形成されるまで、5％CO 2、37℃でインキュベートする。 注：長期的な可能性、真の神経の基本的特性のいずれかを決定するTEMセル、ニューロスフェアは、少なくとも5〜10継代継代する必要があります。また、このような結果が12月14日の中の一部で物議を解釈に関する文献を参照してください。 10。ニューロスフェア培養の分化プライマリまたは継代神経球を決定するために多能性分化させることができる。 それらの培養プレートまたはフラスコから懸濁液中ニューロスフェアを削除し、10cmのプラスチックシャーレに転送。 解剖顕微鏡下でP20ピペットを用いて培地から約15から20のニューロスフェアを取り除き、成長因子およびPDL /ラミニンコーティングしたカバースリップすることなく、培地を含む24ウェルプレートに移す。 5％CO 2、37℃で約7日間分化。 室温で20分間、4％PFAで固定し、任意の死んだ細胞を除去するためにPBSで差別ニューロスフェアを洗ってください。 RにPBSで再び洗浄します4℃で1ミリリットルPBS中ウェル内の任意のPFAや店舗カバース​​リップを残したまま削除 11。ニューロスフェアと接着培養の免疫染色 注意 ：O4抗体で染色するためのブロッキングと染色の手順からトリトンを省略して、適切なIgM抗体二次抗体を使用してください。 室温で60分間（0.2％トリトンX-100を含有するPBS中10％正常ロバ血清）をブロッキング溶液中で分化した神経球または接着単層培養物を含有するカバースリップをインキュベートする。 プライマリBIII-チューブリン、Map2a + bは、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）または室温で60分間O4抗体を含有する新鮮なブロッキング溶液中でインキュベートする。 PBSで3回洗浄します。 暗所で室温で30分間、適切な蛍光結合二次抗体および4,6 – ジアミジノ-2 – フェニルインドール（DAPI 1:5,000）を含有する新鮮なブロッキング溶液中でインキュベートする。 <lI> PBSで3回洗浄する。 暗い晩に蛍光封入し、空気乾燥を用いて顕微鏡スライド上にカバースリップをマウント蛍光顕微鏡を使用してビューとイメージ。