Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

1. Impostazioni di base e preparazione della Cultura Media Almeno due giorni prima di iniziare l'esperimento, preparare Poly-D-lisina (PDL) / laminina rivestito piastre per colture monostrato aderenti. Per preparare pozzetti / boccette voglio abbastanza PDL (10 mg / ml in dH 2 O) per rivestire la superficie e incubare una notte a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione dal piatto e lavare il piatto tre volte con dH 2 O. Lasciare asciugare all'aria. Aggiungere laminina (5 mg / ml in DMEM freddo: F12) e incubare a 37 ° C per una notte. Rimuovere la laminina e utilizzare le piastre immediatamente o conservare con la laminina a -20 ° C fino all'utilizzo. Preparare fuoco pipette lucido con "medium" e "piccoli" fori da pipette Pasteur in vetro rotante in una fiamma finché i bordi si arrotondano. Autoclave per sterilizzare. Il giorno della dissezione, preparare la giusta quantità di terreno di coltura miscelando Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg / ml di eparina, 50 unità / ml di penicillina / streptomicina, 20 ng / ml purificato topo fattore di crescita epidermico-grade (EGF), e 20 ng / ml di fattore di crescita dei fibroblasti ricombinante bovina (FGF-2). Riscaldare il terreno di coltura a 37 ° C in un bagno d'acqua. Per la dissociazione SVZ, preparare 0,05% tripsina-EDTA e 0,125 mg / ml inibitore della tripsina contenente 0,01 mg / ml DNaseI. Equilibrare queste soluzioni a 37 ° C. Impostare un microscopio dissezione e preparare gli strumenti necessari per rimuovere il cervello (forbici e piccola spatola) e SVZ e DG dissezioni (bisturi, 27 ago G attaccato alla siringa da 1 ml, 1 x # 7 pinze, 1 x # 5/45 forcipe) per immersione in etanolo al 70%. 2. La raccolta dei cervelli di topo adulto e SVZ / DG Microdissections Anestetizzare (8 settimane di età) topi adulti non sposati secondo le linee guida istituzionali appropriati. Eseguire dislocazione cervicale. Spruzzare la testa con etanolo al 70% per sterilizzare l'area e di minimizzare la quantità di pelo che undHères le forbici e il cervello. Utilizzando forbici affilate decapitano l'animale alla base del tronco cerebrale. Tenendo la testa alla base del cranio, tagliare il cranio tra le due bulbi olfattivi mettendo una lama di un piccolo paio di forbici in ciascuna cavità occhio e taglio coronale. Quindi, fare due tagli laterali alla base del cranio, seguito da un taglio longitudinale attraverso il cranio lungo la sutura sagittale Attenzione:. Garantiscano l'angolo delle forbici è profonda possibile per evitare di danneggiare il cervello sottostante. Esporre il cervello peeling indietro il cranio sia con la lama delle forbici o un paio di pinze curve. Liberare il cervello dal cranio con una piccola spatola e il luogo in PBS freddo. Risciacquare cervelli con PBS per rimuovere il sangue e la pelliccia. Trasferire cervello per una piastra di Petri 10 centimetri di plastica contenente PBS Porre capsula di Petri contenente il cervello sotto un microscopio da dissezione a basso ingrandimento e posizionare il brain sulla sua superficie ventrale. Utilizzando pinze curve sottili togliere i bulbi olfattivi mentre si tiene il cervello in posizione dal cervelletto. Ruotare il cervello sul dorso e con un bisturi fare un taglio coronale attraverso il cervello a livello del chiasma ottico Per microdissect SVZ (per informazioni più dettagliate, si veda anche Azari et al. 10), posizionare la porzione rostrale del cervello in modo che la superficie coronale tagliata rivolta verso l'alto e mettere a fuoco il microscopio su un ingrandimento maggiore. Rimuovere e gettare il setto con pinze curve sottili. Sezionare il SVZ (il sottile strato di tessuto circostante ventricolo) posizionando immediatamente la punta di una lama di una coppia di pinze curve sottili nell'angolo laterale del ventricolo laterale immediatamente sotto il corpo calloso e le altre di circa 1 mm nel tessuto adiacente al ventricolo. Premere la pinza verso la base del piatto e verso l'aspetto ventrale del VentRicolo per rimuovere un piccolo pezzo triangolare di tessuto. Posizionare la SVZ sezionato in una capsula di Petri sul ghiaccio. Per microdissect DG (per informazioni più dettagliate, si veda anche Hagihara et al. 11), posizionare la porzione caudale del cervello nella scatola di Petri e tagliare lungo la fessura longitudinale con un bisturi. Sotto un microscopio dissezione, rimuovere il cervelletto e il diencefalo con pinze. Ridefinire il microscopio in modo che i bordi intorno DG sono ora visibili. Per rimuovere il giro dentato, inserire la punta di un ago 27 G e scorrono lungo il confine tra la DG e corno di Ammon. Utilizzando le belle pinze, liberare il DG dal tessuto circostante. 3. SVZ Tissue Dissociazione Tritare il tessuto con una lama da bisturi per circa 1 minuto fino a quando non rimangono pezzi di grandi dimensioni. Trasferire il tessuto tritato in una provetta da 15 ml usando 1 ml di preriscaldata 0,05% tripsina-EDTA e incubare per 7 min inbagnomaria a 37 ° C. Per fermare la reazione enzimatica, aggiungere 1 ml di inibitore della tripsina contenenti DNaseI e mescolare il contenuto muovendo il tubo. Pellet la sospensione per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti e scartare il surnatante Risospendere il pellet in 1 ml di mezzo di crescita e di dissociare pipettando gentilmente su e giù per circa 7-10x con una pipetta P1000. Attenzione: nel corso di triturazione può portare ad un aumento della morte cellulare e avrà un impatto negativo sulla crescita delle cellule successive. Aggiungere mezzo di crescita per un volume totale di 5 ml e passare la sospensione cellulare attraverso un setaccio da 40 mm a rimuovere i detriti e grumi di tessuto indissociate. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet con conseguente 200 ml mezzo di crescita. 4. DG Tissue Dissociazione Tritare il tessuto con una lama da bisturi per circa 1 minuto fino a quando non pezzi di grandi dimensioni rimangono e trasferimentoin preriscaldata PDD enzima papaina mix (2,5 U / ml, dispasi 1 U / ml, DNaseI 250 U / ml). Incubare per 20 min a 37 ° C, mescolando per inversione ogni 3-5 minuti. Dissociare il tessuto meccanicamente con un foro medio, fuoco lucido, pipetta Pasteur pipettando su e giù delicatamente 10x. Incubare per altri 10 min a 37 ° C, mescolando per inversione ogni 3-5 minuti. Ulteriori dissociare il tessuto meccanicamente con un piccolo foro, incendio lucidato pipetta Pasteur pipettando su e giù delicatamente 10x. Centrifugare a 130 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di soluzione tampone (1x HBSS, glucosio 30 mM, 2 HEPES mM (pH 7.4), 26 NaHCO mm 3). Portare a 10 ml con soluzione tampone. Centrifugare a 130 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di 20% Percoll. (Per preparare Percoll 90%, aggiungere 4,5 ml di 100% Percoll a 0,5 ml di PBS 10x diluire ulteriormente questo al 20%aggiungendo 1,1 ml di Percoll 90% a 3,9 ml 1x PBS). Centrifugare a 450 xg per 15 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di tampone. Centrifugare a 130 xg per 5 min. Risospendere il pellet in 200 microlitri mezzo di crescita. 5. Generazione di culture Aderente monostrato Piatto SVZ dissociato o DG tessuto in un unico PDL / laminina rivestito pozzetto di una piastra a 96 pozzetti ed incubare a 37 ° C con 5% di CO 2. Circa 24 ore dopo la placcatura, una volta che le cellule hanno aderito alla superficie rivestita, scambiare il mezzo di crescita per rimuovere ulteriori detriti in eccesso. Ogni successivi 3-4 giorni, scambio metà del terreno di coltura con terreno fresco per reintegrare i fattori di crescita. Ripetere finché le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza e sono pronti per essere diversi passaggi. Nota: il tempo tra la placcatura e il primo passaggio può richiedere fino a 2-3 settimane. <pclass = "jove_title"> 6. Passaging delle Culture Aderente monostrato Quando le colture raggiungono circa l'80% di confluenza rimuovere il mezzo dal pozzo e lavare con PBS. Nota: Non permettere alle cellule di superare il 90% di confluenza in quanto questo può portare al distacco delle cellule e la formazione di neurosfere e, inoltre, un aumento dei livelli di morte cellulare. Aggiungere 50 ml Accutase e incubare a 37 ° C per 2-3 minuti (controllare per vedere se le cellule sono arrotondate e distaccato). Rimuovere le cellule in una provetta da 15 ml e lavare il bene una volta con PBS e trasferimento al tubo stesso. Diluire le cellule a 5 ml con PBS e centrifugare a 300 xg per 5 min. Per il primo passaggio, diluire cellule per 1 ml e piastra in un PDL / laminina rivestite pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Per passaggi successivi, risospendere le cellule in 200 ml di mezzo di crescita e conteggio con un emocitometro. Piastra a 1 x 10 4 cellule / cm 2 nel pozzetto rivestito dimensioni appropriate o matraccio. </l i> 7. Differenziazione delle Culture Aderente monostrato Per differenziare le colture monostrato aderenti, cellule piastra proliferanti su vetrini rivestiti PDL / laminina ad una densità di 1 x 10 4 cellule / cm 2 in terreno di coltura contenente 20 ng / ml EGF e 10 ng / ml bFGF. Quando le cellule raggiungono circa il 80% di confluenza (solitamente 2 giorni), sostituire il mezzo di crescita su terreno contenente 5 ng / ml bFGF e 0 ng / ml EGF. A seguito di 2 giorni in 5 ng / ml bFGF, sostituire il mezzo con mezzo di coltura in assenza di entrambi i mitogeni per altri 3 giorni Nota:. Durante questo periodo si verifica una notevole quantità di cellule morte. Dopo un totale di 5 giorni, lavare le cellule differenziate con PBS per rimuovere eventuali cellule morte poi fissare con 4% paraformaldeide (PFA) per 20 min a temperatura ambiente. Lavare nuovamente con PBS per rimuovere eventuali vetrini PFA e conservare in pozzi in 1 ml di PBS a 4 ° C. jove_title "> 8. neurosfere Cultura e quantificazione Diluire il SVZ dissociato o DG tessuto da un animale in 20 ml di terreno di coltura e piastra 200 ml / pozzetto in una piastra a 96 pozzetti utilizzando un multidoser pipetta 10 ml. Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 6-7 giorni per neurosfere SVZ-derivati ​​e 10-12 giorni per neurosfere DG-derivati. Nota: crescita per più di questi tempi di incubazione raccomandati comporterà crescita eccessiva e porterà alla morte delle cellule al centro delle neurosfere e / o, attacco spontaneo e differenziazione. Contare e misurare il diametro delle neurosfere usando un reticolo oculare montato su un microscopio ottico verticale 9. Passaging le Neurosfere Dopo le neurosfere primarie sono stati contati e la loro dimensione registrate possono essere espanse su diversi passaggi che iniziano con un singolo neurosfere o di una cultura di massa. Bulk espansione cultura neurosfere Per passaggio neurosfere combinati come una cultura di massa, rimuovere il terreno contenente le neurosfere dalla piastra, trasferire in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 min. Eliminare il supernatante e risospendere le neurosfere in 1 ml di preriscaldata 0,05% tripsina-EDTA e incubare a temperatura ambiente per 3 min. Aggiungere un uguale volume di inibitore della tripsina contenente DNaseI e mescolare bene. Centrifugare per 5 minuti a 300 xg, rimuovere il supernatante e aggiungere 1 ml di terreno di coltura. Triturare su e giù circa 10x con una pipetta P1000 dissociare le neurosfere. Rimuovere 10 ml della sospensione di cellule e mescolare con un volume uguale di blu tripano ed eseguire un conteggio di cellule in vivo con un emocitometro. Reinizializzare le cellule ad una densità di 1 x 10 4 cellule / cm 2 in coltura appropriato cella dimensioni pozzetto o bottiglia. Incubare a 37 ° Ccon il 5% di CO 2 fino a forma neurosfere secondarie. Espansione neurosfere singolo Per il passaggio singoli neurosfere scegliete pozzetti che contengono un singolo neurosfere e rimuovere con attenzione e scartare circa 160 ml di terreno di coltura di ogni bene senza disturbare il neurosfere. Aggiungere 100 ml di 0,05% tripsina-EDTA a ciascun pozzetto per essere diversi passaggi e incubare a temperatura ambiente per 3 min. Aggiungere 100 ml di inibitore della tripsina contenente DNAseI per arrestare la reazione. Triturare circa 10 volte su e giù con una pipetta P200 di spezzare il neurosfere. Trasferire 200 ml contenenti il ​​neurosfere dissociato in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti contenente 1,5 ml di mezzo di crescita. Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 fino a forma neurosfere secondarie. Nota: per determinare il potenziale a lungo termine, una delle proprietà cardinali di un vero s neuralecellula TEM, neurosfere dovrebbe essere diversi passaggi per almeno 5-10 passaggi. Vedere anche la letteratura sulla parte nella controversa interpretazione dei risultati 12-14. 10. Differenziazione delle Culture neurosfere Neurosfere primarie o diversi passaggi possono essere differenziati per determinare multipotenzialità. Rimuovere neurosfere in sospensione dalla loro piastra di coltura o di pallone e trasferirli su una piastra di Petri 10 centimetri di plastica. Sotto un microscopio dissezione rimuovere circa 15-20 neurosfere dal mezzo con una pipetta P20 e trasferire ad una piastra a 24 pozzetti contenenti il ​​terreno di coltura senza fattori di crescita e un vetrino rivestito PDL / laminina. Differenziare per circa 7 giorni a 37 ° C con 5% di CO 2. Lavare le neurosfere differenziati con PBS per rimuovere tutte le cellule morte poi fissare con PFA 4% per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare nuovamente con PBS per rTogliete eventuali coprioggetto PFA e conservare in pozzi in 1 ml di PBS a 4 ° C 11. Immunostaining di neurosfere e culture aderenti Nota: Per la colorazione con l'anticorpo O4 omettere il Triton dai gradini di blocco e di colorazione e ricordarsi di utilizzare un anticorpo secondario IgM appropriato. Incubare i vetrini contenenti i neurosfere dissociati o colture monostrato aderenti in soluzione (10% siero normale Donkey in PBS contenente 0,2% Triton X-100) di blocco per 60 min a temperatura ambiente. Incubare in soluzione bloccante fresco contenente primario bIII-tubulina, Map2a + b, gliale fibrillare proteina acida (GFAP) o anticorpi O4 per 60min a temperatura ambiente. Lavare 3x con PBS. Incubare in soluzione bloccante fresco contenente appropriati anticorpi secondari coniugati fluorescenza e 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 1/5.000) per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. <li> lavare tre volte con PBS. Montare i coprioggetti su vetrini da microscopio utilizzando il montaggio fluorescenza medie e aria secca nella notte scura Vista e immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza.