Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

1. Configuração básica e Preparação de Meio de Cultura Pelo menos, dois dias antes do início do ensaio, preparar poli-D-lisina (PDL) / laminina placas revestidas para culturas em monocamada aderente. Para preparar poços / frascos adicionar suficiente PDL (10 mg / ml em dH2O) para revestir a superfície e incuba-se durante a noite à temperatura ambiente. Remover a solução a partir da placa e lavar o prato três vezes com dH2O Deixe secar ao ar. Adicionar laminina (5 mg / ml em DMEM frio: F12) e incubar a 37 ° C durante a noite. Retirar a laminina e usar as placas imediatamente ou armazenar com a laminina, a -20 ° C até ser necessário. Prepare fogo pipetas polidas com "médio" e "pequenos" furos girando pipetas Pasteur de vidro em uma chama até que as bordas se tornam arredondadas. Autoclave para esterilizar. No dia da dissecção, preparar a quantidade adequada de meio de cultura através da mistura de Meio Basal Neural com 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg / ml de heparina, 50 unidades / mL de Penicilina / Estreptomicina, / factor de 20 ng ml purificada rato receptor grau de crescimento epidérmico (EGF), e 20 ng / factor de crescimento de fibroblastos bovino recombinante ml (FGF-2). Aquecer o meio de cultura a 37 ° C em um banho de água. Para a dissociação SVZ, preparar 0,05% de tripsina-EDTA e inibidores de 0,125 mg / ml de tripsina contendo 0,01 mg / ml de ADNasel. Equilibrar as soluções a 37 ° C. Configurar um microscópio de dissecação e preparar as ferramentas necessárias para remover o cérebro (tesoura e pequena espátula) e para ZSV e DG dissecções (bisturi, 27 G agulha acoplada a seringa de 1 ml, 1 x # 7 fórceps, 1 x # 5/45 fórceps) por imersão em etanol a 70%. 2. Colheita de cérebros adultos rato e SVZ / DG microdissecações Anestesiar adulto solteiro (8 semanas de idade) ratos de acordo com as diretrizes institucionais apropriados. Realizar deslocamento cervical. Pulveriza-se a cabeça com 70% de etanol para esterilizar a área e para minimizar a quantidade de pele que umdHères para as tesouras e cérebro. Usando uma tesoura afiada decapitar o animal na base do tronco cerebral. Segurando a cabeça na base do crânio, corte no crânio entre os dois bulbos olfatórios, colocando uma lâmina de um pequeno par de tesouras em cada cavidade ocular e corte coronal. Em seguida, fazer dois cortes laterais na base do crânio, seguido por um corte longitudinal através do crânio, ao longo da sutura sagital Cuidado:. Garantir o ângulo da tesoura é tão superficial quanto possível para evitar danos no cérebro subjacente. Exponha o cérebro por trás do crânio descascando ou com a lâmina da tesoura ou um par de fórceps curvos. Livre o cérebro do crânio utilizando uma pequena espátula e coloque em PBS frio. Lavar cérebros com PBS para remover sangue e pele. Transferir cérebros para um prato de Petri 10 centímetros de plástico contendo PBS Coloque placa de Petri contendo o cérebro sob um microscópio de dissecação em baixa ampliação e posicione o brain na sua superfície ventral. Usando pinças curvas finas remover os bulbos olfativos, mantendo o cérebro em posição pelo cerebelo. Girar o cérebro para o aspecto dorsal e, usando um bisturi fazer um corte coronal através do cérebro ao nível do quiasma Para microdissect o ZSV (para obter instruções mais detalhadas, consulte também Azari et al. 10), coloque a parte rostral do cérebro, de modo que a superfície coronal cortado virado para cima e foco do microscópio para uma maior ampliação. Remova e descarte o septo usando uma pinça curva finas. Dissecar a SVZ (a fina camada de tecido em torno do ventrículo) colocando a ponta de uma lâmina de uma par de pinças curvas finas no canto lateral do ventrículo lateral imediatamente sob o corpo caloso e outros cerca de 1 mm para dentro do tecido imediatamente adjacente ao ventrículo. Pressione para baixo a pinça em direção à base do prato e para a face ventral do Ventr.igo para remover uma pequena peça triangular de tecido. Coloque a SVZ dissecados numa caixa de Petri sobre gelo. Para microdissect o DG (para obter instruções mais detalhadas, consulte também Hagihara et al. 11), coloque a porção caudal do cérebro na placa de Petri e corte ao longo da fissura longitudinal usando um bisturi. Sob um microscópio de dissecção, remover o cerebelo e do diencéfalo utilizando fórceps. Reorientar o microscópio para que as bordas ao redor do DG são agora visíveis. Para remover o giro denteado, insira a ponta de uma agulha 27 G e deslizar ao longo da fronteira entre a DG e corno de Ammon. Usando fórceps finos, libertar o DG a partir do tecido circundante. 3. ZSV dissociação Tissue Picar o tecido usando uma lâmina de bisturi para cerca de 1 min até que não há grandes peças permanecem. Transferir o tecido moído para um tubo de 15 ml usando 1 ml de pré-aquecida de 0,05% de tripsina-EDTA e incubar durante 7 min, emum banho de água regulado para 37 ° C. Para interromper a reação enzimática, adicionar 1 ml de inibidor de tripsina contendo DNaseI e misturar o conteúdo sacudindo o tubo. Pellet da suspensão por centrifugação a 300 xg durante 5 minutos e descarta-se o sobrenadante Ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de crescimento e dissociar cuidado pipetando para cima e para baixo de aproximadamente 7-10x com uma pipeta P1000 Cuidado:. Sobre trituração pode levar ao aumento da morte celular e terá um impacto negativo no crescimento celular subseqüente. Adicionar meio de crescimento para um volume total de 5 ml e passar a suspensão de células através de uma peneira de 40 milímetros para remover detritos e aglomerados de tecido não dissociada. Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante e ressuspender o sedimento resultante em 200 ml de meio de crescimento. 4. DG dissociação Tissue Picar o tecido usando uma lâmina de bisturi para cerca de 1 min até que não há grandes peças permanecem e transferênciaem pré-aquecido mistura de enzima papaína (DCP 2,5 U / mL, dispase 1 U / ml, a ADNasel de 250 U / ml). Incubar durante 20 min a 37 ° C, misturando por inversão do tubo a cada 3-5 minutos. Dissociar o tecido usando mecanicamente um furo médio, o fogo polido, Pasteur pipeta pipetando cima e para baixo suavemente 10x. Incubar durante mais 10 min a 37 ° C, misturando por inversão do tubo a cada 3-5 minutos. Além disso dissociar o tecido usando um pequeno furo mecanicamente, fogo polido Pasteur pipeta pipetando cima e para baixo suavemente 10x. Centrifugar a 130 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de solução tampão (1x HBSS, glicose 30 mM, HEPES 2 mM (pH 7,4), 26 mM de NaHCO 3). Make up para 10 ml com solução tampão. Centrifugar a 130 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de 20% de Percoll. (Para preparar 90% de Percoll, adicionar 4,5 ml de 100% de Percoll para 0,5 ml de PBS 10x, em seguida, dilua ainda mais esta a 20%por adição de 1,1 ml de 90% de Percoll com 3,9 ml de PBS 1x). Centrifugar 450 g durante 15 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de tampão. Centrifugar a 130 xg durante 5 min. Ressuspender o sedimento em 200 ul de meio de crescimento. 5. Geração de culturas aderentes em monocamada Placa SVZ dissociada ou DG tecido numa única PDL / laminina revestido poço de uma placa de 96 poços e incuba-se a 37 ° C com 5% de CO 2. Aproximadamente 24 horas após o plaqueamento, uma vez que as células tenham aderido à superfície revestida, trocar o meio de crescimento para remover o excesso de detritos adicional. A cada 3-4 dias subsequentes, a troca de metade do meio de crescimento com meio fresco para repor os factores de crescimento. Repita até as células atingirem aproximadamente 80% de confluência e está pronto para ser passado Nota:. Tempo entre revestimento e a primeira passagem podem levar até 2-3 semanas. <pclass = "jove_title"> 6. Passaging de culturas aderentes monocamada Quando as culturas atingem cerca de 80% de confluência remover o meio do poço e lava-se com PBS. Nota: Não permitir que as células a ser superior a 90% da confluência como esta pode levar ao desprendimento de células e formação neuroesfera e, além disso, níveis aumentados de morte celular. Adicionar 50 ml de Accutase e incubar a 37 ° C durante 2-3 minutos (a verificação para ver se as células são arredondadas e isolada). Remover as células para um tubo de 15 ml e lava-se bem a uma vez com PBS e transferir para o mesmo tubo. Dilui-se as células para 5 ml com PBS e centrifugar 300 xg durante 5 min. Para a primeira passagem, diluir as células a 1 ml e a placa em uma PDL / laminina revestido poço de uma placa de 24 poços. Para passagens subsequentes, ressuspender as células em 200 ml de meio de crescimento e a contagem utilizando um hemocitómetro. Placa de 1 x 10 4 células / cm 2 no poço revestido com tamanho adequado ou balão. </l i> 7. Diferenciação de culturas aderentes monocamada Para diferenciar as culturas em monocamada, as células aderentes placa proliferar em PDL / Laminin lamelas revestidas a uma densidade de 1 x 10 4 células / cm2 em meio de crescimento contendo 20 ng / mL de EGF e 10 ng / ml de bFGF. Quando as células atingem cerca de 80% de confluência (normalmente 2 dias), substituir o meio de crescimento com meio contendo 5 ng / mL de bFGF e 0 ng / mL de EGF. Seguindo 2 dias em 5 ng / ml de bFGF, substituir o meio com meio de crescimento na ausência de ambos mitogénios por mais 3 dias Nota:. Durante este período de uma quantidade significativa de morte celular ocorre. Depois de um total de 5 dias, lavar as células diferenciadas com PBS para remover as células mortas, em seguida, fixar com 4% de paraformaldeído (PFA), durante 20 min à temperatura ambiente. Lavar novamente com PBS, para remover qualquer lamelas PFA e armazenar em poços em 1 ml de PBS a 4 ° C. jove_title "> 8. Neurosphere Cultura e Quantificação Dilui-se a SVZ dissociada ou DG tecido de um animal, em 20 ml de meio de cultura e a placa 200 mL / cavidade em uma placa de 96 cavidades utilizando uma pipeta de 10 ml multidoser. Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 6-7 dias para as neuroesferas SVZ derivados e 10-12 dias para neuroesferas DG-derivados. Nota: o crescimento de mais do que estes tempos de incubação recomendadas irá resultar numa proliferação e vai levar a morte celular no centro dos neuroesferas e / ou, de fixação e de diferenciação espontânea. Contar e medir o diâmetro dos neurospheres usando um retícula ocular montado um microscópio de luz vertical 9. Passagem das neuroesferas Após os neurospheres primários foram contadas e seu tamanho registrado que pode ser expandida ao longo de várias passagens, começando com um único neurosphere ou uma cultura em massa. Granel expansão cultura neurosphere Para passagem neuroesferas combinados como um volume de cultura, remover o meio contendo as neuroesferas da placa, transferir para um tubo de 15 ml e centrifugar a 300 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender as neuroesferas em 1 ml de pré-aquecida de 0,05% de tripsina-EDTA e incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Adicionar um volume igual de inibidor de tripsina contendo ADNasel e misturar bem. Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg, remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio de crescimento. Triturar cima e para baixo cerca de 10x com uma pipeta P1000 dissociar as neurospheres. Retirar 10 mL da suspensão de células e mistura com um volume igual de azul de tripano e realizar uma contagem de células vivas utilizando um hemocitómetro. Reseed as células a uma densidade de 1 x 10 4 células / cm 2 na cultura de células de tamanho adequado bem ou frasco. Incubar a 37 ° Ccom 5% de CO2 até se formarem neuroesferas secundárias. Expansão neurosphere Único Para passagem de neuroesferas individuais escolher poços que contêm um único neuroesfera e cuidadosamente remover e descartar cerca de 160 ul de meio de crescimento de cada cavidade sem perturbar o neuroesfera. Adicionar 100 ml de 0,05% de tripsina-EDTA a cada poço a ser passadas e incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Adicionar 100 ul de inibidor de tripsina contendo DNAseI para parar a reacção. Triturar aproximadamente 10 vezes para cima e para baixo com uma pipeta P200 para quebrar o neurosphere. Transferir 200 ml contendo o neuroesfera dissociado de um novo poço de uma placa de 24 poços contendo 1,5 mL de meio de crescimento. Incubar a 37 ° C com 5% de CO2 até se formarem neuroesferas secundárias. Nota: para determinar o potencial de longo prazo, uma das propriedades fundamentais de um verdadeiro s neuraiscélula temperatura, neuroesferas devem ser passadas por pelo menos 5-10 passagens. Veja também a literatura sobre a interpretação controversa em parte de tais resultados 12-14. 10. Diferenciação das Culturas neurosphere Neurospheres primárias ou subculturas podem ser diferenciados para determinar multipotencialidade. Remover neurospheres em suspensão de sua placa de cultura ou frasco e transferi-los para de 10 cm de plástico placa de Petri. Sob um microscópio de dissecção remover aproximadamente 15-20 neuroesferas a partir do meio utilizando uma pipeta de P20 e transferir para uma placa de 24 poços contendo meio de cultura, sem factores de crescimento e uma lamela revestida PDL / laminina. Diferenciar em cerca de 7 dias a 37 ° C com 5% de CO 2. Lavar as neuroesferas diferenciadas com PBS para remover as células mortas, em seguida, fixar com PFA a 4% durante 20 min à temperatura ambiente. Lavar novamente com PBS para retirar quaisquer lamelas PFA e armazenar em poços em 1 ml de PBS a 4 ° C 11. Imunocoloração de Neurosphere e culturas aderentes Nota: Para a coloração com o anticorpo O4 omitir a Triton das etapas de bloqueio e de coloração e lembre-se de usar um anticorpo IgM secundário apropriado. Incubar as lamelas contendo as neuroesferas diferenciadas ou culturas em monocamada aderente na solução (10% soro normal Donkey em PBS contendo 0,2% de Triton X-100) de bloqueio, durante 60 minutos à temperatura ambiente. Incubar em solução de bloqueio fresco contendo primário BIII-tubulina, Map2a + b, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) ou anticorpos O4 durante 60 min a temperatura ambiente. Lavar 3x com PBS. Incubar em solução de bloqueio fresco contendo anticorpos secundários conjugados com fluorescência adequados e 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; 1:5000) durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. <li> Lavar três vezes com PBS. Montar as lamelas em lâminas de microscópio de fluorescência usando montagem médio e ar seco no escuro durante a noite Ver e imagem usando um microscópio de fluorescência.