Une souris, deux cultures: Isolement et culture des cellules souches adultes de neurones à partir des deux Neurogenic Zones de souris individuelle

Une. Configuration de base et la préparation de milieu de culture Au moins deux jours avant le début de l'expérience, la préparation de poly-D-lysine (PDL) / laminine plaques revêtues de cultures monocouches adhérentes. Pour préparer les puits / flacons ajouter assez PDL (10 mg / ml en DH 2 O) pour revêtir la surface et incuber pendant une nuit à température ambiante. Retirer la solution de l'antenne et laver la capsule trois fois avec dH 2 O. Laisser sécher à l'air. Ajouter laminine (5 mg / ml dans du DMEM froid: F12) et incuber à 37 ° C pendant une nuit. Retirez la laminine et soit utiliser les plaques immédiatement ou conserver la laminine à -20 ° C jusqu'à utilisation. Préparer feu pipettes polies avec "moyen" et "petits" trous en tournant pipettes Pasteur en verre dans une flamme jusqu'à ce que les bords s'arrondissent. Autoclave pour stériliser. Le jour de la dissection, de préparer la quantité appropriée de milieu de culture en mélangeant Neural Milieu de base avec 2% de B27, 1x GlutaMAX, 2 mg / ml d'héparine, 50 unités / ml de pénicilline / streptomycine, 20 ng / ml de facteur purifié de croissance épidermique récepteur teneur souris (EGF), et 20 ng / facteur de croissance de fibroblaste bovine recombinée ml (FGF-2). Chauffer le milieu de culture à 37 ° C dans un bain d'eau. Pour la dissociation SVZ, préparer à 0,05% de trypsine-EDTA et 0,125 mg / ml inhibiteur de trypsine contenant 0,01 mg / ml de DNase I. Équilibrer ces solutions à 37 ° C. Mettre en place un microscope de dissection et de préparer les outils nécessaires pour enlever le cerveau (ciseaux et petite spatule) et pour SVZ et DG dissections (scalpel, 27 G aiguille fixée à seringue de 1 ml, 1 x # 7 forceps, 1 x # 5/45 forceps) par trempage dans l'éthanol à 70%. 2. La récolte des cerveaux de souris adultes et SVZ / DG Microdissections Anesthésier adulte seul (8 semaines d'âge) chez la souris selon les directives institutionnelles appropriées. Effectuer dislocation cervicale. Pulvériser la tête avec 70% d'éthanol pour stériliser la zone et de réduire au minimum la quantité de poils qui adHères les ciseaux et le cerveau. À l'aide de ciseaux décapitent l'animal à la base du tronc cérébral. Tenant la tête à la base du crâne, couper le crâne entre les deux bulbes olfactifs en plaçant une lame d'une petite paire de ciseaux dans chaque cavité de l'œil et de coupe coronaire. Ensuite, faire deux coupes latérales à la base du crâne, suivie par une coupe longitudinale à travers le crâne le long de la suture sagittale Attention:. Assurent l'angle des ciseaux est aussi faible que possible pour éviter d'endommager le cerveau sous-jacent. Exposer le cerveau en enlevant le crâne soit avec la lame de ciseaux ou une paire de pinces courbes. Libérer le cerveau du crâne à l'aide d'une petite spatule et le lieu dans PBS froid. Rincer cerveau avec du PBS pour éliminer le sang et de la fourrure. Transfert cerveau à une boîte de Pétri de 10 cm en plastique contenant du PBS Placez boîte de Pétri contenant le cerveau sous un microscope de dissection à faible grossissement et positionner le brain sur sa face ventrale. Utilisation de fines pinces courbes enlever les bulbes olfactifs tout en maintenant le cerveau en position par le cervelet. Tourner le cerveau sur la face dorsale et l'aide d'un scalpel faire une coupe coronale par le cerveau au niveau du chiasma optique Pour microdissect la SVZ (pour des instructions plus détaillées, voir aussi Azari et al. 10), placer la partie rostrale du cerveau de sorte que la surface coronale couper tourné vers le haut et de se concentrer le microscope sur un plus fort grossissement. Retirer et jeter le septum à l'aide de fines pinces courbes. Disséquer la SVZ (la fine couche de tissu entourant le ventricule) en plaçant l'extrémité d'une pale d'une paire de fines pinces incurvées dans l'angle latéral du ventricule latéral immédiatement sous le corps calleux et les autres d'environ 1 mm immédiatement dans le tissu adjacent au ventricule. Presser vers le bas la pince vers la base de la capsule et vers la face ventrale de la VentRicle pour enlever un petit morceau de tissu triangulaire. Placez le SVZ disséqué dans une boîte de Pétri sur de la glace. Pour microdissect la DG (pour des instructions plus détaillées, voir aussi Hagihara et al. 11), placer la partie caudale du cerveau dans la boîte de Pétri et couper le long de la fissure longitudinale à l'aide d'un scalpel. Sous un microscope de dissection, retirez le cervelet et le diencéphale l'aide de pinces. Recentrer le microscope de sorte que les frontières autour de la DG sont maintenant visibles. Pour supprimer le gyrus denté, insérez la pointe d'une aiguille 27 G et glissent le long de la frontière entre la DG et la corne d'Ammon. En utilisant les pince fine, libérer le DG du tissu environnant. 3. La dissociation des tissus SVZ Hacher le tissu en utilisant une lame de scalpel pendant environ 1 minute jusqu'à ce que aucun gros morceaux restent. Transférer le tissu haché à un tube de 15 ml en utilisant 1 ml d'préchauffé 0,05% de trypsine-EDTA et laisser incuber pendant 7 min àun bain-marie réglé à 37 ° C. Pour arrêter la réaction enzymatique, ajouter 1 ml d'inhibiteur de trypsine contenant DNaseI et mélanger le contenu en feuilletant le tube. Pellet la suspension par centrifugation à 300 g pendant 5 min et jeter le surnageant Reprendre le culot dans 1 ml de milieu de croissance et dissocier par pipetage de haut en bas environ 7 à 10 fois à l'aide d'une pipette P1000 Attention:. Sur trituration peut conduire à la mort cellulaire accrue et aura un impact négatif sur la croissance cellulaire ultérieure. Ajouter milieu de croissance pour un volume total de 5 ml et passer la suspension de cellules à travers un tamis de 40 mm pour enlever les débris et amas de tissus non dissociés. Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot obtenu dans 200 ml de milieu de croissance. 4. DG dissociation tissulaire Hacher le tissu en utilisant une lame de scalpel pendant environ 1 minute jusqu'à ce que aucun gros morceaux restent transfert eten mélange préchauffé PDD enzyme papaïne (2,5 U / ml de dispase, 1 U / ml, la DNase I 250 U / ml). Incuber pendant 20 min à 37 ° C, le mélange en inversant le tube tout 3-5 min. Dissocier le tissu mécaniquement à l'aide d'un alésage moyen, feu poli, pipette Pasteur par aspiration et doucement 10x. Incuber pendant 10 minutes supplémentaires à 37 ° C, le mélange en inversant le tube tout 3-5 min. Dissocier davantage le tissu mécaniquement à l'aide d'un petit trou, le feu poli pipette Pasteur par aspiration et doucement 10x. Centrifuger à 130 g pendant 5 min. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans une solution de tampon ml (1 x HBSS, 30 mM de glucose, 2 mM de HEPES (pH 7,4), 26 mM NaHCO 3). Compléter à 10 ml avec la solution tampon. Centrifuger à 130 g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 5 ml de 20% de Percoll. (Pour la préparation de Percoll à 90%, ajouter 4,5 ml de 100% de Percoll à 0,5 ml de PBS puis diluer 10 fois plus loin à 20%en ajoutant 1,1 ml de Percoll 90% à 3,9 ml 1x PBS). Centrifuger 450 g pendant 15 min. Enlever le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 ml de tampon. Centrifuger à 130 g pendant 5 min. Remettre en suspension le culot dans du milieu de croissance de 200 ul. 5. Génération des cultures monocouches adhérentes Plaque la SVZ dissocié ou DG tissu en un seul PDL / laminine ainsi revêtu d'une plaque de 96 puits et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. Environ 24 heures après l'étalement, une fois que les cellules ont adhéré à la surface revêtue, échanger le milieu de culture pour éliminer encore des débris en excès. Tous les 3-4 jours suivants, l'échange de la moitié du milieu de culture par du milieu frais pour reconstituer les facteurs de croissance. Répétez jusqu'à ce que les cellules atteignent environ 80% de confluence et sont prêts à être repiquées. Remarque: le temps entre le placage et le premier passage peut prendre jusqu'à 2-3 semaines. <pclass = "jove_title"> 6. Le repiquage des cultures monocouches adhérentes Lorsque les cultures atteignent environ 80% de confluence éliminer le milieu du puits et laver avec du PBS. Note: Ne pas laisser les cellules dépassent 90% de confluence, car cela peut conduire à un détachement des cellules et la formation de neurosphères et en plus, l'augmentation des niveaux de la mort cellulaire. Ajouter 50 ml Accutase et incuber à 37 ° C pendant 2-3 min (vérifier si les cellules sont arrondis et détaché). Éliminer les cellules à un tube de 15 ml et on lave le puits une fois avec du PBS et transférer dans le même tube. Diluer les cellules à 5 ml avec du PBS et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Pour le premier passage, diluer les cellules à 1 ml et de la plaque dans un PDL / laminine bien revêtue d'une plaque à 24 puits. Pour les passages ultérieurs, remettre les cellules dans 200 ml de milieu de croissance et de comptage en utilisant un hémocytomètre. Plaque à 1 x 10 4 cellules / cm 2 dans le puits revêtu de taille appropriée ou le flacon. </l i> 7. Différenciation des cultures monocouches adhérentes Pour différencier les cultures monocouches adhérentes, des cellules proliférantes de la plaque sur PDL / laminine lamelles couvre-objet enduites à une densité de 1 x 10 4 cellules / cm 2 dans un milieu de croissance contenant 20 ng / ml d'EGF et 10 ng ml de bFGF /. Lorsque les cellules atteignent une confluence d'environ 80% (généralement de 2 jours), remplacer le milieu de croissance avec du milieu contenant 5 ng / ml de bFGF et 0 ng / ml d'EGF. Après 2 jours de 5 ng / ml de bFGF, remplacer le milieu par du milieu de croissance en l'absence des deux mitogènes pendant encore 3 jours. Remarque: au cours de cette période une quantité significative de la mort cellulaire se produit. Après un total de 5 jours, laver les cellules différenciées avec du PBS pour éliminer toutes les cellules mortes puis fixer avec du paraformaldéhyde 4% (PFA) pendant 20 min à température ambiante. Laver ensuite avec PBS pour enlever les lamelles PFA et magasins dans les puits dans 1 ml de PBS à 4 ° C. jove_title "> 8. Neurosphère Culture et quantification Diluer la SVZ dissocié ou DG tissus d'un animal dans 20 ml de milieu de culture et de la plaque 200 ml / puits dans une plaque à 96 puits en utilisant une pipette Multidoser 10 ml. Incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 6-7 jours pour neurosphères dérivées SVZ et de 10 à 12 jours pour les neurosphères dérivées DG. Remarque: la croissance pendant plus de ces temps d'incubation recommandées va entraîner la prolifération et va conduire à la mort cellulaire dans le centre de neurosphères et / ou de fixation, et la différenciation spontanée. Compter et mesurer le diamètre des neurosphères l'aide d'un réticule de l'oculaire monté sur un microscope optique verticale 9. Repiquer les Neurosphères Après les neurosphères primaires ont été comptés et leur taille enregistrée ils peuvent être étendus sur plusieurs passages commençant par soit un seul neurosphère ou une culture en masse. L'expansion de la culture de neurosphères en vrac Pour passage neurosphères combinés comme une culture en masse, retirez le support contenant les neurosphères de la plaque, transférer à un tube de 15 ml et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les neurosphères dans 1 ml d'préchauffé 0,05% de trypsine-EDTA et incuber à température ambiante pendant 3 min. Ajouter un volume égal d'inhibiteur de trypsine contenant DNaseI et bien mélanger. Centrifugeuse pendant 5 min à 300 g, éliminer le surnageant et ajouter 1 ml de milieu de croissance. Triturer et une baisse d'environ 10x avec une pipette P1000 de dissocier les neurosphères. Retirer 10 ml de la suspension cellulaire et de mélange avec un volume égal de bleu trypan et effectuer un comptage des cellules vivantes l'aide d'un hématimètre. Réensemencer les cellules à une densité de 1 x 10 4 cellules / cm 2 dans la culture de cellules de taille appropriée ou bien ballon. Incuber à 37 ° Cavec 5% de CO 2 jusqu'à neurosphères secondaires forme. L'expansion de neurosphère unique Pour le passage des neurosphères individuelles choisir les puits qui contiennent une seule neurosphères et soigneusement retirer et jeter environ 160 ul de milieu de croissance de chaque puits, sans perturber le neurosphères. Ajouter 100 ml de 0,05% de trypsine-EDTA à chaque puits pour être repiquées et incuber à température ambiante pendant 3 min. Ajouter 100 ul d'inhibiteur de trypsine contenant ADNase I pour arrêter la réaction. Triturer environ 10 fois haut et bas avec une pipette P200 pour briser la neurosphère. Transférer les 200 ml contenant le neurosphères dissocié à un nouveau puits d'une plaque à 24 puits contenant 1,5 ml de milieu de croissance. Incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 jusqu'à neurosphères secondaires forme. Remarque: pour déterminer le potentiel à long terme, l'une des propriétés cardinales d'un vrai s neuronauxcellule TEM, neurosphères doivent être repiquées pendant au moins 5 à 10 passages. Voir aussi la littérature sur la partie interprétation controversée de ces résultats 12-14. 10. Différenciation des cultures neurosphère Neurosphères primaires ou à des passages peuvent être différenciées pour déterminer multipotentialité. Retirer neurosphères en suspension de leur plaque de culture ou ballon et de les transférer à une boîte de Pétri de 10 cm en plastique. Sous un microscope de dissection supprimer environ 15-20 neurosphères à partir du milieu à l'aide d'une pipette P20 et transférer sur une plaque de 24 puits contenant le milieu de culture sans facteurs de croissance et une lamelle enduit PDL / laminine. Différencier pendant environ 7 jours à 37 ° C avec 5% de CO 2. Laver les neurosphères différenciés avec du PBS pour éliminer les cellules mortes, puis fixer avec 4% de PFA pendant 20 min à température ambiante. Laver ensuite avec PBS à rEDéplacez des lamelles PFA et magasins dans les puits dans 1 ml de PBS à 4 ° C 11. Immunomarquage de Neurosphère et cultures adhérentes Remarque: Pour la coloration avec l'anticorps O4 omettre le Triton du blocage et de coloration étapes et n'oubliez pas d'utiliser un anticorps IgM secondaire approprié. Incuber les lamelles contenant les neurosphères différenciées ou des cultures monocouches adhérentes en solution (10% de sérum d'âne normal dans du PBS contenant 0,2% de Triton X-100) de blocage pendant 60 min à température ambiante. Incuber dans une solution de blocage frais contenant primaire bIII-tubuline, MAP2a + b, protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) ou des anticorps O4 pour 60min à température ambiante. Laver 3 fois avec PBS. Incuber dans une solution de blocage frais contenant fluorescence des anticorps secondaires conjugués appropriés et 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI; 1:5000) pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité. <li> Laver trois fois avec du PBS. Monter les lamelles sur des lames de microscope utilisant la fluorescence milieu de montage et de l'air sec dans l'obscurité pendant une nuit Voir et de l'image en utilisant un microscope à fluorescence.