Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

1. Basic Setup und Vorbereitung von Kulturmedium Mindestens zwei Tage vor Beginn des Experiments vorbereitet Poly-D-Lysin (PDL) / Laminin beschichteten Platten für adhärente Monolayer-Kulturen. Zur Vorbereitung Wells / Kolben fügen Sie genug PDL (10 mg / ml in dH 2 O), um die Oberfläche und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Lösung aus dem Gericht und dem Gericht waschen dreimal mit dH 2 O. An der Luft trocknen. In Laminin (5 mg / ml in kaltem DMEM: F12) und bei 37 ° C über Nacht. Entfernen Sie die Laminin und entweder die Platten sofort oder zu speichern mit dem Laminin bei -20 ° C, bis sie benötigt. Bereiten feuerpolierte Pipetten mit "mittel" und "klein" Bohrungen durch rotierende Glaspasteurpipetten in einer Flamme, bis die Kanten abgerundet werden. Autoklav zu sterilisieren. Am Tag der Präparation, bereiten Sie die entsprechende Menge an Kulturmedium durch Mischen Neural Basal Medium mit 2% B27, 1x Glutamax, 2 mg / ml Heparin, 50 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin, 20 ng / ml gereinigtem Maus-Rezeptor-Klasse epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 20 ng / ml rekombinantem Rinder-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF-2). Erwärmen des Kulturmediums auf 37 º C in einem Wasserbad. Für die SVZ Dissoziation vorzubereiten 0,05% Trypsin-EDTA und 0,125 mg / ml Trypsin-Inhibitor, enthaltend 0,01 mg / ml DNaseI. Äquilibrieren dieser Lösungen auf 37 ° C Eine Dissektionsmikroskop Set und bereiten die notwendigen Werkzeuge, um das Gehirn (Schere und kleinen Spatel) zu entfernen und für SVZ und der GD Dissektionen (Skalpell, 27 G-Nadel auf 1 ml Spritze befestigt, 1 x Nr. 7 Zange, 1 x # 5/45 Zange) durch Eintauchen in 70% Ethanol. 2. Die Ernte der erwachsenen Maus Brains und SVZ / DG Mikrodissektionen Anesthetize einzelnen Erwachsenen (8 Wochen alt)-Mäusen nach den entsprechenden Richtlinien des Instituts. Führen Genickbruch. Sprühen Sie den Kopf mit 70% Ethanol, um den Bereich zu sterilisieren und die Menge von Pelz zu minimieren, dass eindHères der Schere und Gehirn. Mit einer scharfen Schere enthaupten das Tier an der Basis des Hirnstamms. Halten Sie den Kopf an der Basis des Schädels, schneiden Sie den Schädel zwischen den beiden Riechkolben, indem Sie ein Blatt eines kleinen Schere in jede Augenhöhle und Schneid koronal. Als nächstes stellen zwei seitliche Schnitte an der Basis des Schädels, gefolgt durch einen Längsschnitt durch den Schädel entlang der Pfeilnaht. Vorsicht: sicherzustellen, dass der Winkel der Schere so flach wie möglich zu beschädigen die zugrunde liegende Gehirn ist. Setzen Sie das Gehirn durch den Schädel zurück Peeling entweder mit der Klinge der Schere oder einem Paar von gebogenen Pinzette. Befreie das Gehirn aus dem Schädel mit einem kleinen Spachtel und Ort in kaltes PBS. Spülen mit PBS Gehirn, Blut und Fell zu entfernen. Übertragen Gehirn zu einer 10 cm Kunststoffpetrischale mit PBS Zeigen Petrischale mit dem Gehirn unter einem Binokular bei geringer Vergrößerung und die Position der brain auf der Bauchseite. Mit feinen gebogenen Pinzette entfernen Sie die Riechkolben, während das Gehirn hält in Position durch das Kleinhirn. Drehen Sie das Gehirn auf den dorsalen und mit einem Skalpell einen koronalen Schnitt durch das Gehirn auf der Ebene des Chiasma Um die SVZ microdissect (detaillierte Anleitung dazu finden Sie auch Azari et al. 10), legen Sie den rostralen Teil des Gehirns, so dass der Schnitt koronalen Oberfläche nach oben zeigt und sich das Mikroskop auf eine höhere Vergrößerung. Entfernen und Entsorgen der Scheidewand mit feinen gebogenen Pinzette. Präparieren Sie die SVZ (die dünne Schicht um den Ventrikel Gewebe), indem Sie die Spitze einer Klinge von einer feinen gebogenen Pinzette in der lateralen Ecke des lateralen Ventrikel unmittelbar unter dem Corpus callosum und den anderen etwa 1 mm in das Gewebe sofort angrenzend an den Ventrikel. Drücken Sie die Zange in Richtung der Basis der Schale und in Richtung der ventralen Aspekt der ventrkel, eine kleine dreieckige Stück Gewebe zu entfernen. Legen Sie die seziert SVZ in eine Petrischale auf Eis. Um die DG microdissect (detaillierte Anleitung dazu finden Sie auch Hagihara et al. 11), legen Sie die Schwanz Teil des Gehirns, in der Petrischale und entlang der Längsspalte mit einem Skalpell geschnitten. Unter einem Dissektionsmikroskop, entfernen Sie das Kleinhirn und Zwischenhirn mit einer Pinzette. Refocus das Mikroskop, so dass die Ränder um das DG sind nun sichtbar. Um den Gyrus dentatus zu entfernen, führen Sie die Spitze einer 27 G-Nadel und entlang der Grenze zwischen der DG und Ammonshorn. Mit den feinen Pinzette, befreit das DG aus dem umgebenden Gewebe. 3. SVZ Gewebedissoziation Mince das Gewebe mit einem Skalpell für ca. 1 min bis keine großen Stücke bleiben. Übertragen des zerkleinerten Gewebes mit einem 15-ml-Röhrchen mit 1 ml vorgewärmtes 0,05% Trypsin-EDTA und Inkubation für 7 min inein Wasserbad auf 37 ° C eingestellt Um die enzymatische Reaktion zu stoppen, 1 ml Trypsin-Inhibitor enthält DNaseI und mischen Sie den Inhalt durch Schwenken des Rohres. Pellet der Suspension durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min und den Überstand verwerfen Das Pellet in 1 ml Wachstumsmedium und distanzieren sich ausdrücklich von sanft und Abpipettieren ca. 7-10x mit einem P1000 Pipette. Vorsicht: über Verreiben kann zu erhöhten Zelltod führen und sich negativ auf die nachfolgenden Zellwachstum auswirken. In Wachstumsmedium auf ein Gesamtvolumen von 5 ml und übergeben die Zellsuspension durch ein 40-mm-Sieb, um Schmutz und undissoziierten Gewebeklumpen zu entfernen. Zentrifuge bei 300 × g für 5 Minuten, Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der resultierenden Pellets in 200 ml Wachstumsmedium. 4. DG Gewebedissoziation Hackfleisch das Gewebe unter Verwendung einer Skalpellklinge für etwa 1 min bis keine große Stücke bleiben und TransferPDD in vorgewärmtem Enzym-Mix (Papain 2,5 U / ml Dispase 1 U / ml DNase I 250 U / ml). Inkubation für 20 min bei 37 ° C, Mischen durch Umdrehen des Röhrchens alle 3-5 min. Distanzieren das Gewebe mechanisch mit einer mittleren Bohrung, feuerpolierte, Pasteur-Pipette durch Auf-und Abpipettieren vorsichtig 10x. Inkubation für weitere 10 min bei 37 ° C, Mischen durch Umdrehen des Röhrchens alle 3-5 min. Weitere distanzieren das Gewebe mechanisch mit einer kleinen Bohrung, poliert Feuer Pasteur-Pipette durch Auf-und Abpipettieren vorsichtig 10x. Zentrifugieren bei 130 × g für 5 min. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 1 ml Pufferlösung (1x HBSS, 30 mM Glucose, 2 mM HEPES (pH 7,4), 26 mM NaHCO 3). Stellen Sie bis zu 10 ml mit Pufferlösung. Zentrifugieren bei 130 × g für 5 min. Überstand abnehmen und das Pellet in 5 ml 20% Percoll. (So ​​bereiten 90% Percoll, fügen Sie 4,5 ml 100% Percoll zu 0,5 ml 10x PBS verdünnen diese dann weiter auf 20%durch Zugabe von 1,1 ml 90% Percoll auf 3,9 ml 1x PBS). Zentrifuge 450 g für 15 min. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 10 ml Puffer. Zentrifugieren bei 130 × g für 5 min. Das Pellet in 200 ul Wachstumsmedium. 5. Erzeugung von adhärenten Monolayer-Kulturen Platte der dissoziierten SVZ oder DG Gewebe in einem einzigen PDL / Laminin Vertiefung einer 96-Well-Platte beschichtet und bei 37 ° C mit 5% CO 2. Ungefähr 24 Stunden nach der Plattierung, wenn die Zellen an der beschichteten Oberfläche haftet, tauschen das Wachstumsmedium, um überschüssige Schmutz weiter zu entfernen. Jeder weitere 3-4 Tage, Austausch Hälfte des Wachstumsmediums mit frischem Medium, um die Wachstumsfaktoren wieder aufzufüllen. Wiederholen, bis die Zellen zu erreichen ca. 80% Konfluenz und sind bereit, agiert werden. Hinweis: die Zeit zwischen der Beschichtung und den ersten Durchgang kann bis zu 2-3 Wochen dauern. <pclass = "jove_title"> 6. Die Passage von adhärenten Monolayer-Kulturen Wenn die Kulturen etwa 80% Konfluenz entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen und waschen mit PBS. Hinweis: Nicht in die Zellen zu 90% Konfluenz überschreiten, da dies zur Ablösung von Zellen und Neurosphärenbildung und darüber hinaus führen, erhöhte Zelltod. 50 ml Accutase und bei 37 ° C für 2-3 min (zu überprüfen, ob die Zellen sind gerundet und Haus). Entfernen Sie die Zellen in ein 15-ml-Tube und waschen das auch einmal mit PBS und Transfer in das gleiche Rohr. Verdünnte Zellen mit 5 ml PBS und Zentrifuge 300 × g für 5 min. Für den ersten Durchgang, verdünnten Zellen auf 1 ml und die Platte in eine PDL / Laminin Vertiefung einer 24-Well-Platte überzogen. Für die folgenden Passagen, Die Zellen in 200 ml Wachstumsmedium und Zahl mit einer Zählkammer. Teller mit 1 x 10 4 Zellen / cm 2 in der entsprechenden Größe und beschichtete oder Kolben. </l i> 7. Differenzierung von adhärenten Monolayer-Kulturen Die anhaftenden Monolayer-Kulturen, Platte proliferierenden Zellen auf PDL / Laminin beschichteten Deckgläschen in einer Dichte von 1 x 10 4 Zellen / cm 2 in Wachstumsmedium mit 20 ng / ml EGF und 10 ng / ml bFGF unterscheiden. Wenn die Zellen etwa 80% Konfluenz (in der Regel 2 Tage) zu erreichen, ersetzen Sie das Wachstumsmedium mit Medium mit 5 ng / ml bFGF und 0 ng / ml EGF. Nach 2 Tage 5 ng / ml bFGF Ersetzen des Mediums mit Wachstumsmedium in Abwesenheit von beiden Mitogene für weitere 3 Tage Anmerkung:. Während dieser Zeit eine signifikante Menge an Zelltod auftritt. Nach insgesamt 5 Tage, waschen Sie die differenzierten Zellen mit PBS auf tote Zellen zu entfernen, dann fix mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Wieder mit PBS waschen, um alle PFA und speichern Deckgläser in Bohrlöchern in 1 ml PBS bei 4 ° C entfernen jove_title "> 8. Neurosphäre, Kultur und Quantifizierung Verdünnt das dissoziierte SVZ oder DG Gewebe von einem Tier in 20 ml Kulturmedium und der Platte 200 ml / Vertiefung in eine 96-Well-Platte unter Verwendung einer 10 ml Pipette Multidoser. Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 6-7 Tage SVZ abgeleiteten Neurosphären und 10-12 Tage für DG abgeleiteten Neurosphären. Hinweis: Wachstum für mehr als diese empfohlenen Inkubationszeiten in Überwucherung führen und den Zelltod in der Mitte der Neurosphären und / oder spontane Anhaftung und Differenzierung führen. Graf und messen den Durchmesser der Neurosphären mit einem Okular-Strichplatte in eine aufrechte Lichtmikroskop montiert 9. Passagieren der Neurosphären Nachdem die primären Neurosphären wurden gezählt und ihre Größe aufgezeichnet sie über mehrere Passagen beginnen entweder mit einem einzelnen oder einer Neurosphäre Groß Kultur erweitert werden. Massenkultur Neurosphäre Expansion Um Durchgang kombiniert Neurosphären als Massenkultur, entfernen Sie das Medium, das die Neurosphären von der Platte, Transfer in ein 15-ml-Tube und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der Neurosphären in 1 ml vorgewärmtes 0,05% Trypsin-EDTA und Inkubation bei Raumtemperatur für 3 min. Gleiches Volumen von Trypsin-Inhibitor enthält DNaseI und gut mischen. Zentrifuge für 5 min bei 300 g, der Überstand entfernt und 1 ml Wachstumsmedium. Man reibt auf und ab etwa 10x mit einem P1000 Pipette, um die Neurosphären zu trennen. Entfernen 10 ml der Zellsuspension und mit dem gleichen Volumen Trypanblau mischen und durchzuführen, eine Live-Zellzahl mit einer Zählkammer. Reseed die Zellen in einer Dichte von 1 x 10 4 Zellen / cm 2 in der geeigneten Größe der Zellkultur gut oder Kolben. Bei 37 ° Cmit 5% CO 2 bis sekundären Neurosphären bilden. Einzelneurosphäre Expansion Um einzelne Durchgang Neurosphären wählen Brunnen, die eine einzelne Neurosphäre enthalten und sorgfältig entfernen und entsorgen ca. 160 ul des Wachstumsmediums von jedem gut ohne die Neurosphäre zu stören. 100 ml von 0,05% Trypsin-EDTA zu jeder Vertiefung zu agiert werden und bei Raumtemperatur für 3 min. 100 l Trypsin-Inhibitor enthält DNAseI, um die Reaktion zu stoppen. Man reibt etwa 10 mal nach oben und unten mit einer Pipette auf P200 brechen die Neurosphäre. Übertragen Sie die 200 ml, der die dissoziierten Neurosphären zu einer neuen Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 1,5 ml Wachstumsmedium. Bei 37 ° C mit 5% CO 2 bis sekundären Neurosphären bilden. Hinweis: Um langfristige Potenzial, einer der Kardinal Eigenschaften eines echten Nerven s bestimmenTEM-Zelle sollte Neurosphären für mindestens 5-10 Passagen agiert werden. Siehe auch die Literatur zum Teil umstrittene Interpretation solcher Ergebnisse 14.12. 10. Differenzierung der Neurosphäre Kulturen Primär oder agiert Neurosphären unterschieden multipotentiality zu bestimmen. Neurosphären in Suspension entfernen von ihren Kulturplatte oder Kolben und sie auf einer 10 cm Petrischale aus Kunststoff. Unter einem Dissektionsmikroskop entfernen ca. 15-20 Neurosphären aus dem Medium mit einer Pipette P20 und Transfer zu einer 24-Well-Platte, die die Kulturmedium ohne Wachstumsfaktoren und einer PDL / Laminin beschichteten Deckglas. Differenzierung für etwa 7 Tage bei 37 ° C mit 5% CO 2. Waschen Sie die differenzierten Neurosphären mit PBS auf tote Zellen zu entfernen, dann fix mit 4% PFA für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Wieder mit PBS waschen rntfernen keine PFA und speichern Deckgläser in Bohrlöchern in 1 ml PBS bei 4 ° C 11. Immunfärbung von Neurosphäre und adhärenten Kulturen Hinweis: Für die Färbung mit dem Antikörper O4 weglassen Triton aus den Sperr-und Färbeschritte und denken Sie daran, eine geeignete IgM Sekundärantikörper zu verwenden. Inkubiere die Deckgläser mit den differenzierten Neurosphären oder adhärente Monolayer-Kulturen in Blockierungslösung (10% normalem Eselserum in PBS, enthaltend 0,2% Triton X-100) für 60 min bei Raumtemperatur. Inkubation in frischem Blockierungslösung mit primären bIII-Tubulin, Map2a + b, saure Gliafaserprotein (GFAP) oder O4 Antikörper für 60min bei Raumtemperatur. 3x Waschen mit PBS. Inkubieren in frisch Blockierungslösung, die geeignete Fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörpern und 4,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI; 1:5000) für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. <li> mit PBS waschen dreimal. Montieren Sie die Deckgläser auf Objektträger mittels Fluoreszenz-Eindeckmedium und an der Luft trocknen über Nacht im Dunkeln Ansicht und Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop.