Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler'den Kök Hücre

1.. Temel Kurulum ve Kültür Orta hazırlanması En az iki gün önce deney başlamadan, Poly-D-lisin (PDL) / Laminin yapışkan tek tabakalı kültürler için levha kaplı hazırlar. Kuyu / şişeler yüzeyin kaplanması için, yeterli PDL (dH 2 O 10 mg / ml) ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe hazırlamak. Çanak çözüm çıkarın ve dH 2 O. ile çanak üç defa yıkamak Kurumaya bırakın. Laminin (soğuk DMEM'de 5 mg / ml: F12) ilave edin ve bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Laminin çıkarın ve ya derhal ya da plakaların kullanılması gerekene kadar -20 ° C 'de, laminin ile saklayın. Kenarları yuvarlatılmış haline gelene kadar bir alevle cam Pasteur pipetler çevirerek "orta" ve "küçük" delikleri ile yangın cilalı pipetler hazırlayın. Sterilize etmek otoklavlayın. Diseksiyon gününde,% 2 B27, 1x Glutamax, 2 mg / ml heparin ile Nöral Bazal Ortamda karıştırılarak kültür ortamının uygun miktarda hazırlanması 50 birim / ml Penisilin / Streptomisin, 20 ng / ml saflaştırılmış fare reseptörü dereceli epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 20 ng / ml yeniden birleştirici sığır fibroblast büyüme faktörü (FGF-2). Bir su banyosu içerisinde 37 ° C'ye kadar kültür ortamı ısıtın. SVZ ayrışma için,% 0.05 tripsin-EDTA hazırlamak ve 0.125 mg / ml tripsin 0.01 mg / ml DNase içeren inhibitör. 37 ° C'ye bu çözümleri Denge Bir diseksiyon mikroskobu kurmak ve beyin (makas ve küçük spatula) çıkarın ve SVZ'unda ve DG diseksiyonlarla (bisturi, 1 ml şırınga bağlı 27 G iğne, 1 x # 7 forseps, 1 x # 5/45 için gerekli araçları hazırlamak % 70 etanol içinde ıslatılmasıyla forseps). 2. Yetişkin Fare Brain ve SVZ'una / DG Microdissections Hasat Uygun kurumsal kurallarına göre tek yetişkin (8 haftalık) fareler anestezisi. Servikal dislokasyon gerçekleştirin. Alan sterilize etmek ve kürk miktarını en aza indirmek için% 70 etanol ile baş Sprey birmakas ve beyin dheres. Kullanarak keskin makas beyin sapının dibinde hayvan başını kesmek. Her bir göz boşluğu içine makas küçük bir çiftin bir bıçak yerleştirme ve koronal keserek iki koku ampuller arasında kafatası kesilmiş, kafatası tabanında baş tutarak. . Makas açısı yatan beyin zarar görmesini önlemek için mümkün olduğunca sığ sağlamak: Sonraki, Dikkat sagital sütür boyunca kafatası yoluyla uzunlamasına bir kesim tarafından takip kafatasının dibinde iki yan keser, yapmak. Makas, bıçak ya da kavisli bir forseps ya bir çift ile kafatası soyulması ile beyin Açığa. Soğuk PBS içine küçük bir spatula ve yer kullanarak kafatası beyni özgür. Kan ve kürk çıkarmak için PBS ile beyinleri durulayın. PBS içeren bir 10 cm plastik Petri beynini transfer Düşük büyütmede bir diseksiyon mikroskop altında beyin içeren Petri yerleştirin ve Brai konumlandırmakventral yüzeyi üzerinde n. Beyincik tarafından pozisyonunda beyin tutarken ince kavisli bir forseps kullanarak koku ampuller çıkarın. Dorsal üzerine beyin döndürün ve bir neşter kullanılarak kiazmada düzeyinde beyin aracılığıyla koronal kesim yapmak Svz microdissect için (Daha ayrıntılı talimatlar için, Azari ve ark. 10. ayrıca bkz), kesilmiş koronal yüzey yukarı bakacak şekilde beynin rostral kısmını yerleştirin ve daha yüksek bir büyütme üzerine mikroskop odak. Çıkarın ve ince kavisli bir forseps kullanarak septum atın. Hemen hemen dokuya KK ve diğer yaklaşık 1 mm altında, yan ventrikül yan köşesinde iyi eğri forseps bir çiftin bir bıçak ucu yerleştirerek svz (ventrikül çevreleyen doku ince tabaka) teşrih ventriküle komşu. Yemeğin tabanına doğru ve ventr ventral doğru forseps aşağı bastırınicle doku küçük bir üçgen parça kaldırmak için. Buz üzerinde bir Petri kabı içine disseke svz yerleştirin. DG microdissect için (Daha ayrıntılı talimatlar için, Hagihara vd. 11. ayrıca bkz), Petri kabı ve bir neşter kullanılarak uzunlamasına fissür birlikte kesti beynin kaudal kısmını yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında, forseps kullanarak beyincik ve diensefalonu çıkarın. DG etrafında sınırların artık görünür böylece mikroskop yönlendirmesi. Dentat girus kaldırmak için, DG ve Ammon boynuzu arasındaki sınır boyunca bir 27 G iğne ve slayt ucu takın. Ince forseps kullanarak, çevreleyen dokudan DG ücretsiz. 3. SVZ'una Doku Ayrılma Hiçbir büyük parça kalmayıncaya kadar yaklaşık 1 dakika boyunca bir neşter bıçak kullanarak doku kıyma. Önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin-EDTA kullanılarak 1 ml bir 15 ml tüp kıyılmış doku aktarın ve 7 dakika boyunca inkübeBir su banyosu 37 ° C olarak ayarlanmış , Enzimatik reaksiyonu durdurmak DNaseI içeren tripsin inhibitörü 1 ml ekleyin ve tüp hafifçe vurarak içerikleri karıştırmak için. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile süspansiyon Pelet ve supernatant atmak Büyüme ortamı içinde 1 ml pelletini ve yavaşça bir P1000 Dikkat pipet kullanarak aşağı, yaklaşık 7-10x yukarı pipetleme ile ayrışır:. Öğütülerek fazla artmış hücre ölümüne yol açabilir ve daha sonra negatif hücre büyümesi üzerinde etkisi olacaktır. 5 ml'lik bir toplam hacme büyüme ortamı ilave edin ve enkaz ve ayrışmamış doku kümeleri kaldırmak için bir 40 mm bir elekten hücre süspansiyonu geçmektedir. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj, süpernatant atmak ve 200 ml büyüme ortamı içinde elde edilen pelet tekrar süspansiyon. 4. DG Doku Ayrılma Hiçbir büyük parça kalması ve transfer kadar yaklaşık 1 dakika boyunca bir neşter bıçak kullanarak doku Kıymaönceden ısıtılmış PDD enzim karışımı (Papain 2.5 U / ml, Dispase 1 U / ml, DNaseI 250 U / mi). Tüpü, her 3-5 dakikada bir çevirerek karıştırma, 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. Mekanik orta delik kullanılarak doku ayırmak, hafifçe aşağı 10x yukarı pipetleme, Pasteur pipet cilalı yangın. Tüpü, her 3-5 dakikada bir çevirerek karıştırma, 37 ° C'de ilave bir 10 dakika boyunca inkübe edin. Dahası, mekanik bir küçük delik kullanılarak doku ayırmak, yangın yavaşça aşağı 10x yukarı pipetleme ve Pasteur pipet cilalı. 5 dakika boyunca 130 x g'de santrifüj. Süpernatantı ve 1 ml tampon çözeltisi (1x HBSS, 30 mM glikoz, 2 mM HEPES (pH 7.4), 26 mM NaHCO 3) 'de pelletini. Tampon çözeltisi ile 10 ml'ye tamamlanır. 5 dakika boyunca 130 x g'de santrifüj. Süpernatantı ve% 20 Percoll 5 ml pelletini. (10x 0.5 ml PBS,% 100 Percoll 4.5 ml eklemek,% 90 Percoll hazırlanması için daha sonra% 20 bu seyreltik3,9 ml 1 x PBS) 1.1 ml% 90 Percoll ekleyerek. 15 dakika boyunca 450 xg santrifüjleyin. Süpernatantı ve 10 ml tampon maddesi içinde pelletini. 5 dakika boyunca 130 x g'de santrifüj. 200 ul büyüme ortamında pelletini. 5. Yapışık tabakalı Kültürlerin Üretimi 96 oyuklu bir plakanın de kaplanmış tek bir PDL / laminin içine ayrışmış svz veya DG doku Plate ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. Hücreler kaplanmış yüzeye yapışık bir kez yaklaşık olarak 24 saat sonra kaplama, daha fazla kalıntıları çıkarmak için büyüme ortamı değişimi. Her sonraki 3-4 gün sonra, büyüme faktörleri doldurmak için taze ortam ile büyüme ortamının kuru yarısı. . Hücreler yaklaşık% 80 confluency ulaşmak ve pasajlanır hazır Not olana kadar tekrarlayın: kaplama ve ilk geçişi arasındaki süre 2-3 hafta kadar sürebilir. <pclass = "jove_title"> 6. Yapışık Tek tabakalı Kültürlerin Pasajlanması Kültürler, yaklaşık% 80 ortak akışkanlığa ulaştıklarında kuyudan orta kaldırmak ve PBS ile yıkayın. Not: Hücre ölümü artmış seviyeleri, bu hücrelerin ayrılması ve neurosphere oluşumu ve ek olarak yol açabilir olarak hücreler% 90 konfluent aşmasına izin vermeyin. 50 ml Accutase ekleyin ve 2-3 dk (hücreleri yuvarlak ve müstakil olup olmadığını görmek için kontrol) için 37 ° C'de inkübe. Bir 15 ml tüp hücreleri çıkarın ve iyi bir kez PBS ile yıkayın ve aynı tüpe aktarın. PBS ile 5 ml ve 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj hücreleri seyreltin. İlk geçit için, 1 ml hücre seyreltin ve 24 yuvalı plakanın kaplanmış bir PDL / laminin içine plaka. Daha sonra geçişleri için, 200 ml büyüme ortamı ve sayımı bir hemasitometre kullanarak içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Plaka 1 x 10 4 hücre uygun büyüklükte kaplanmış kuyuda veya şişede / cm 2. </l i> 7. Yapışık Tek tabakalı Kültürlerin Farklılaşma 20 ng / ml EGF ve 10 ng / ml bFGF ihtiva eden büyüme ortamı içinde 1 x 10 4 hücre / cm 2 yoğunluğunda PDL / laminin kaplanmış, kapak slipleri üzerine yapışık tek tabaka kültürleri, levha çoğalan hücreleri ayırt etmek için. Hücreler, yaklaşık% 80 ortak akışkanlığa (genellikle 2 gün) ulaştığında, ortam 5 ng / ml bFGF ve 0 ng / ml EGF içeren büyüme ortamı değiştirin. 5 ng / ml bFGF 2 gün sonra, ilave bir 3 gün boyunca her iki mitojen yokluğunda büyüme ortamı ile orta yerine Not:. Bu süre esnasında hücre ölümü, önemli miktarda ortaya çıkar. 5 günlük bir toplam sonra, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) ile düzeltme daha sonra herhangi bir ölü hücreleri çıkarmak için PBS ile farklılaşmış hücreleri yıkayın. 4 ° C'de 1 ml PBS içinde kuyu herhangi bir PFA ve saklamak lamelleri çıkarmak için PBS ile tekrar yıkanır jove_title "> 8. Neurosphere Kültür ve Ölçümü Kültür ortamı, 20 ml bir hayvandan ya da ayrışmış svz DG doku seyreltin ve 10 ml multidoser pipet kullanarak, 96 oyuklu bir plaka üzerinde 200 ml / oyuk plaka. DG türetilmiş neurospheres için SVZ türetilen neurospheres ve 10-12 gün boyunca 6-7 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir. Not: Bu önerilen inkübasyon sürelerinde daha uzun bir süre için büyüme aşırı neden olur ve neurospheres ve / veya kendiliğinden bağlantı ve farklılaşma merkezinde hücre ölümüne yol açar. Saymak ve dik bir ışık mikroskobu yerleştirilmiş bir mercek ağı kullanarak neurospheres çapını ölçmek 9. Neurospheres Pasajlanması Birincil neurospheres sayılır edilmiş ve boyutları kaydedilmiş sonra tek bir neurosphere ya da bir yığın ya da kültürü ile başlayarak birkaç geçişleri fazla genişletilebilir. Bulk kültür neurosphere genleşme Bir kütle kültürü olarak pasaj Birleştirilen neurospheres için, 5 dakika boyunca 300 x g'de, 15 ml tüp ve santrifüje aktarım, plakadan neurospheres içeren orta çıkarın. Süpernatant atılır ve önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin-EDTA 1 ml neurospheres tekrar süspansiyon ve 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. DNasel tripsin inhibitörü içeren eşit hacimde ekleyin ve iyice karıştırın. 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj, süpernatant kaldırmak ve büyüme ortamı içinde 1 ml. Neurospheres ayırmak için bir P1000 pipet ile yukarı ve aşağı yaklaşık 10x çiğnemek. Hücre süspansiyonu 10 ml çıkarın ve tripan mavisi eşit hacmi ile karıştırmak ve bir hemasitometre kullanarak canlı hücre sayımı gerçekleştirin. Uygun büyüklükte bir hücre kültüründe ya da iyi bir şişede / cm 2 1 x 10 4 hücre yoğunluğunda hücreler reseed. 37 ° C'de inkübe% 5 CO 2 ile ikincil neurospheres formu kadar. Tek neurosphere genişleme Geçişi için tek tek neurospheres neurosphere içeren kuyu ve dikkatli bir şekilde seçmek neurosphere bozmadan, her kuyudan büyüme ortamı içinde yaklaşık olarak 160 ul çıkarın ve atın. Her bir geçişli edilmesi için% 0.05 tripsin-EDTA, 100 ml ilave edin ve 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için DNaseI içeren tripsin önleyicisi 100 ul ekle. Öğütün yaklaşık 10 kat yukarı ve Neurosphere parçalayın bir P200 pipet ile aşağı. Büyüme ortamı 1,5 ml ihtiva eden bir 24-yuvalı plakanın yeni bir oyuğuna ayrışmış neurosphere ihtiva eden 200 ml aktarın. İkincil neurospheres oluşana kadar% 5 CO 2 ile 37 ° C'de inkübe edin. Not: uzun vadeli potansiyelini, gerçek bir sinir s kardinal özelliklerinden birini belirlemek içintem hücresi, neurospheres en az 5-10 pasajlar için geçişli olmalıdır. Ayrıca bu tür sonuçların 12-14 part tartışmalı yorumuna literatüre bakınız. 10. Neurosphere Kültürlerin Farklılaşma Birincil veya pasajlanır neurospheres multipotentiality belirlemek için ayırt edilebilir. Kendi kültür plakası ya da şişeden süspansiyon içinde neurospheres çıkarın ve bir 10 cm Plastik Petri tabağına aktarın. , Bir teşhir mikroskopu altında P20 pipet kullanarak ortamından yaklaşık olarak 15-20 neurospheres kaldırmak ve büyüme faktörlerine ve bir PDL / laminin kaplı lamel olmaksızın kültür ortamını ihtiva eden bir 24-iyi levhaya transfer. % 5 CO2 ile 37 ° C'de yaklaşık 7 gün boyunca ayırt edebilecektir. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 PFA ile çözmek daha sonra herhangi bir ölü hücreleri çıkarmak için PBS ile ayrılır neurospheres yıkayın. R PBS ile tekrar yıkanır4 ° C'de 1 ml PBS içinde kuyu herhangi bir PFA ve mağaza lamelleri birikimleri temizlenmelidir 11. Neurosphere ve Yapışık Kültürlerin immün Not: O4 antikoru ile boyama için Triton engelleme ve boyama adımları atlarsanız ve uygun bir IgM ikincil antikor kullanmayı unutmayın. Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca çözeltisi (PBS içinde% 10 normal eşek serumu,% 0.2 Triton X-100 ihtiva eden) engelleme farklılaştırılmış neurospheres veya yapışkan ihtiva eden tek tabaka kültürleri lamelleri inkübe edin. Primer, BIII-tubulin, Map2a + b, glial fibriller asidik protein (GFAP) ya da oda sıcaklığında 60 dakika için O4 antikorları ihtiva eden taze bloke çözeltisi içinde inkübe edin. 3 kez PBS ile yıkayın. Uygun floresan konjuge sekonder antikor ve 4,6-diamidino-2-fenilindol ihtiva eden taze bloke çözeltisi içinde inkübe (DAPI; 1:5,000) karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika karıştırıldı. <li> üç kez PBS ile yıkayın. Karanlık gecede floresan montaj orta ve kuru hava kullanılarak mikroskop lamı üzerine monte lamelleri Bir floresan mikroskop kullanılarak görünümü ve görüntü.