Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

1. Basic Setup en voorbereiding van Cultuur Medium Ten minste twee dagen voor het begin van de proef, bereid poly-D-lysine (PDL) / laminine beklede platen voor hechtende monolayer kweken. Ter voorbereiding putjes / flessen voeg genoeg PDL (10 mg / ml in dH 2 O) het bekleden van het oppervlak en incubeer overnacht bij kamertemperatuur. Verwijder de oplossing uit de schaal en was de schaal driemaal met dH 2 O. Laat aan de lucht drogen. Voeg laminine (5 mg / ml in koude DMEM: F12) en incubeer bij 37 ° C geïncubeerd. Verwijder de Laminine en ofwel onmiddellijk gebruik maken van de platen of op te slaan met de Laminin bij -20 ° C totdat ze nodig waren. Bereid brand gepolijst pipetten met "medium" en "kleine" boringen door het draaien van glas pasteurpipetten in een vlam tot de randen worden afgerond. Autoclaaf te steriliseren. Op de dag van dissectie, bereid de geschikte hoeveelheid kweekmedium door mengen Neural basismedium met 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg / ml heparine, 50 eenheden / ml penicilline / streptomycine, 20 ng / ml gezuiverd muisreceptor kwaliteit epidermale groeifactor (EGF), en 20 ng / ml boviene fibroblast groeifactor (FGF-2). Verwarm het kweekmedium tot 37 ° C in een waterbad. Voor de SVZ dissociatie bereiden 0,05% trypsine-EDTA en 0,125 mg / ml trypsine remmer die 0,01 mg / ml DNasel. Equilibreer deze oplossingen tot 37 ° C. Het opzetten van een dissectie microscoop en de voorbereiding van de instrumenten die nodig zijn om de hersenen (schaar en kleine spatel) te verwijderen en voor SVZ en DG dissecties (scalpel, 27 G naald grenst aan 1 ml spuit, 1 x # 7 tang, 1 x # 5/45 forceps) door onderdompeling in 70% ethanol. 2. Oogsten van volwassen muis Brains en SVZ / DG Microdissections Verdoven alleenstaande volwassene (8 weken oud) muizen volgens de passende institutionele richtlijnen. Voer cervicale dislocatie. Spray het hoofd met 70% ethanol om het gebied te steriliseren en om de hoeveelheid bont minimaliseren dat eendHères de schaar en de hersenen. Met behulp van een scherpe schaar onthoofden het dier aan de basis van de hersenstam. Houd het hoofd bij de basis van de schedel, snijd de schedel tussen de twee reukbollen door het plaatsen van een blad van een kleine schaar in elk oog holte en snijden coronaalwaarts. Maak vervolgens twee zijdelingse sneden aan de basis van de schedel, gevolgd door een longitudinale snede door de schedel langs de pijlnaad. Let op: zorg voor de hoek van de schaar is zo ondiep mogelijk om beschadiging van de onderliggende hersenen. Expose de hersenen door het afpellen van de schedel met ofwel het blad van de schaar of een paar gebogen pincet. Bevrijd de hersenen uit de schedel met een kleine spatel en plaats in koud PBS. Spoel hersenen met PBS om bloed en haren te verwijderen. Transfer hersenen om een ​​10 cm plastic petrischaal met PBS Plaats petrischaal met de hersenen onder een dissectie microscoop bij een lage vergroting en de positie van de brain op het ventrale oppervlak. Met behulp van fijne gebogen pincet verwijder de reukbollen terwijl de hersenen in stand door het cerebellum. Draai de hersenen op de dorsale zijde en met een scalpel een coronale doorsnede door de hersenen op het niveau van de optische chiasma Om de SVZ microdissect (voor meer gedetailleerde instructies, zie ook Azari et al.. 10), plaats de rostrale deel van de hersenen, zodat het snijden coronale oppervlak naar boven wijst en de focus van de microscoop op een hogere vergroting. Verwijderen en het septum gooi met behulp van fijne gebogen pincet. Ontleden de SVZ (het dunne weefsel rondom de ventrikel) door de punt van een blad van een paar fijne gebogen pincet in de laterale hoek van de laterale ventrikel direct onder het corpus callosum en de andere ongeveer 1 mm in het weefsel onmiddellijk grenzend aan het ventrikel. Druk de tang naar de basis van de schaal en naar het ventrale aspect van de ventrIcle een kleine driehoekige stukje weefsel te verwijderen. Plaats de ontleed SVZ in een petrischaal op ijs. Om de DG microdissect (voor meer gedetailleerde instructies, zie ook Hagihara et al.. 11), plaatst het caudale deel van de hersenen in de petrischaal en snijd langs de longitudinale spleet met behulp van een scalpel. Onder een dissectie microscoop, verwijder het cerebellum en de diencephalon behulp van een tang. Heroriëntatie van de microscoop, zodat de randen rond de DG zijn nu zichtbaar. Om de dentate gyrus verwijderen, steek de punt van een 27 G naald en schuif langs de grens tussen de DG en Ammon hoorn. De fijne tang, vrij DG van het omringende weefsel. 3. SVZ Tissue Dissociatie Hak het weefsel met behulp van een scalpel voor ongeveer 1 minuut totdat er geen grote stukken blijven. Breng het gehakt weefsel een 15 ml buisje met 1 ml voorverwarmd 0,05% trypsine-EDTA en incubeer gedurende 7 min ineen waterbad tot 37 ° C. Om de enzymatische reactie te stoppen, voeg 1 ml trypsine-remmer die DNaseI en meng de inhoud door de knop van de buis. Pellet de suspensie door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 minuten en de bovenstaande vloeistof Resuspendeer de pellet in 1 ml groeimedium en distantiëren door de pipet voorzichtig op en neer op ongeveer 7-10x met behulp van een P1000 pipet. Let op: meer dan triturating kan leiden tot verhoogde celdood en zal een negatieve invloed hebben op latere celgroei. Voeg groeimedium tot een totaal volume van 5 ml en laat de celsuspensie door een 40 mm zeef om vuil en gedissocieerde weefsel klonten te verwijderen. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 min, gooi het supernatant en resuspendeer de resulterende pellet in 200 ml groeimedium. 4. DG Tissue Dissociatie Hak het weefsel met behulp van een scalpel voor ongeveer 1 minuut totdat er geen grote stukken blijven en overdrachtin voorverwarmd PDD enzymmengsel (Papaïne 2,5 U / ml, Dispase 1 U / ml DNasel 250 U / ml). Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C, het mengen door het buisje elke 3-5 minuten. Distantiëren het weefsel mechanisch met behulp van een medium boring, vuur gepolijst, Pasteur pipet door en neer te pipetteren voorzichtig 10x. Incubeer nog eens 10 min bij 37 ° C, het mengen door het buisje elke 3-5 minuten. Verder distantiëren het weefsel mechanisch met een kleine boring, brand gepolijst Pasteur pipet door en neer te pipetteren voorzichtig 10x. Centrifugeer bij 130 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml bufferoplossing (1x HBSS, 30 mM glucose, 2 mM HEPES (pH 7,4), 26 mM NaHCO3). Vul aan tot 10 ml met buffer oplossing. Centrifugeer bij 130 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant en resuspendeer de pellet in 5 ml 20% Percoll. (Ter voorbereiding 90% Percoll, voeg 4,5 ml van 100% Percoll tot 0,5 ml van 10x PBS dan is dit verder te verdunnen tot 20%door toevoeging van 1,1 ml 90% Percoll 3,9 ml 1x PBS). Centrifugeer 450 xg gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml buffer. Centrifugeer bij 130 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer de pellet in 200 ul groeimedium. 5. Generatie van Adherente monolaagculturen Plate de gedissocieerde SVZ of DG weefsel in een PDL / laminine beklede put van een 96-well plaat en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2. Ongeveer 24 uur na plating, zodra de cellen hebben gehandeld op het gecoate oppervlak, wisselen het groeimedium om verder te verwijderen overtollige puin. Elke volgende 3-4 dagen, uitwisseling helft van het groeimedium met vers medium om de groeifactoren te vullen. Herhaal dit tot de cellen te bereiken ongeveer 80% confluentie en zijn klaar om te worden gepasseerd. Opmerking: de tijd tussen de platen en de eerste passage kan tot 2-3 weken. <pclass = "jove_title"> 6. Passage van Adherente monolaagculturen Wanneer de culturen te bereiken ongeveer 80% confluentie verwijder het medium uit de put en wassen met PBS. Opmerking: Zorg ervoor dat de cellen tot 90% confluentie overschrijden, omdat dit kan leiden tot onthechting van cellen en neurosfeer vorming en bovendien, verhoogde niveaus van celdood. Voeg 50 ml Accutase en incubeer bij 37 ° C gedurende 2-3 min (controleren of de cellen afgerond en vrijstaande). Verwijder de cellen om een ​​15 ml buisje en was de put eenmaal met PBS en dragen dezelfde buis. Verdun cellen 5 ml met PBS en centrifugeer 300 xg gedurende 5 minuten. Voor de eerste passage, verdunnen cellen tot 1 ml en de plaat in een PDL / Laminin goed gecoat van een 24 wells plaat. Voor de volgende passages, resuspendeer cellen in 200 ml groeimedium en tellen met behulp van een hemocytometer. Plaat bij 1 x 10 4 cellen / cm 2 in de juiste maat beklede put of kolf. </l i> 7. Differentiatie van Adherente monolaagculturen De hechtende monolaag culturen plaat prolifererende cellen differentiëren op PDL / laminine beklede dekglaasjes bij een dichtheid van 1 x 10 4 cellen / cm 2 in groeimedium bevattende 20 ng / ml EGF en 10 ng / ml bFGF. Wanneer de cellen ongeveer 80% confluentie (meestal 2 dagen) te bereiken, vervang het groeimedium met medium dat 5 ng / ml bFGF en 0 ng / ml EGF. Na 2 dagen in 5 ng / ml bFGF, vervang het medium met groeimedium bij ontstentenis van mitogenen voor nog eens 3 dagen. Opmerking: in deze periode een significante hoeveelheid celdood optreedt. Na een totaal van 5 dagen, was de gedifferentieerde cellen met PBS om dode cellen te verwijderen bevestig met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 min bij kamertemperatuur geroerd. Was opnieuw met PBS elk PFA en opslaan dekglaasjes in putjes in 1 ml PBS verwijderen bij 4 ° C. jove_title "> 8. Neurosfeer Cultuur en kwantificering Verdun de gedissocieerde SVZ of DG weefsel van een dier in 20 ml kweekmedium en plaat 200 ml / putje in een 96-wells plaat met een 10 ml pipet multidoser. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 6-7 dagen SVZ afgeleide neurosferen en 10-12 dagen voor DG-afgeleide neurosferen. Opmerking: groei langer dan deze aanbevolen incubatietijd zal overgroei en zal leiden tot celdood in het midden van de neurosferen en / of spontane hechting en differentiatie. Telling en meet de diameter van de neurosferen met een oculairgraticule gemonteerd op een rechtopstaande lichtmicroscoop 9. Passage van de Neurosferen Na de primaire neurosferen zijn geteld en hun grootte afgedrukt kunnen worden uitgebreid over meerdere passages te beginnen met een enkele neurosfeer of een bulk cultuur. Bulkkweek neurosfeer expansie Om passage gecombineerde neurosferen als bulkkweek, verwijder het medium dat de neurosferen van de plaat, overbrengen naar een 15 ml buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de neurosferen in 1 ml voorverwarmd 0,05% trypsine-EDTA en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten. Voeg een gelijk volume trypsineremmer met DNaseI en meng. Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 xg, verwijder het supernatant en voeg 1 ml groeimedium. Vermaal op en neer ongeveer 10x met een P1000 pipet om de neurosferen distantiëren. Verwijder 10 ml van de celsuspensie en mengen met een gelijk volume van trypan blauw en voer een levende celtelling met een hemocytometer. Reseed de cellen bij een dichtheid van 1 x 10 4 cellen / cm 2 in de juiste maat celkweek goed of kolf. Incubeer bij 37 ° Cmet 5% CO 2 tot secundaire neurosferen vorm. Single neurosfeer expansie Om passage individuele neurosferen kiezen putten dat een enkel neurosfeer bevatten en zorgvuldig uit elk putje te verwijderen en gooi ongeveer 160 pl van het groeimedium zonder de neurosphere. Voeg 100 ml van 0,05% trypsine-EDTA aan elk putje worden gepasseerd en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten. Voeg 100 ul trypsine inhibitor met DNAsel om de reactie te stoppen. Vermaal ongeveer 10 keer op en neer met een P200 pipet om uiteen te vallen de neurosphere. Breng 200 ml dat de gedissocieerde neurosphere een nieuw putje van een 24-wells plaat met 1,5 ml groeimedium. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 totdat secundaire neurosferen vormen. Opmerking: op de lange termijn potentieel, een van de kardinale eigenschappen van een echte neurale s bepalenTEM-cel moet neurosferen worden gepasseerd ten minste 5-10 passages. Zie ook de literatuur over de in deel controversiële interpretatie van dergelijke resultaten 12-14. 10. Differentiatie van neurosfeerculturen Primaire of gepasseerd neurosferen kan worden gedifferentieerd om multipotentiality bepalen. Verwijder neurosferen in suspensie van hun cultuur plaat of de kolf en overbrengen naar een 10 cm plastic petrischaal. Onder een dissectie microscoop verwijderen ongeveer 15-20 neurosferen van het medium met behulp van een P20 pipet en over te dragen aan een 24-wells plaat met het kweekmedium zonder groeifactoren en een PDL / Laminin gecoat dekglaasje. Onderscheid gedurende ongeveer 7 dagen bij 37 ° C met 5% CO2. Was de gedifferentieerde neurospheres met PBS om alle dode cellen te verwijderen en bevestig daarna met 4% PFA gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Was opnieuw met PBS aan rchrap elk PFA en opslaan dekglaasjes in putjes in 1 ml PBS bij 4 ° C 11. Immunokleuring van Neurosfeer en Adherente Culturen Opmerking: Voor kleuring met de O4 antilichaam weglaten de Triton van de blokkering en vlekken stappen en vergeet niet om een geschikte IgM secundair antilichaam te gebruiken. Incubeer de dekglaasjes met de gedifferentieerde neurospheres of hechtende monolaag culturen blokkerende oplossing (10% normaal Ezel serum in PBS bevattende 0,2% Triton X-100) gedurende 60 min bij kamertemperatuur. Incubeer in verse blokkerende oplossing die primaire BIII-tubuline, Map2a + b, glia fibrillair zuur eiwit (GFAP) of O4 antilichamen voor 60 min bij kamertemperatuur geroerd. Was 3x met PBS. Incubeer in verse blokkerende oplossing die geschikte fluorescentie geconjugeerde secundaire antilichamen en 4,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 1:5000) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. <li> Was driemaal met PBS. Monteer de dekglaasjes op objectglaasjes met behulp van fluorescentie montage medium en de lucht drogen in het donker 's nachts Bekijk en beeld met behulp van een fluorescentie microscoop.