עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

1. התקנה והכנת בינוני התרבות בסיסית לפחות יומיים לפני תחילת הניסוי, להכין פולי-D-ליזין (PDL) / Laminin מצופה צלחות לתרבויות monolayer חסיד. כדי להכין בארות / צלוחיות להוסיף מספיק PDL (10 מ"ג / מיליליטר ב DH 2 O) למעיילות את פני השטח ודגירת הלילה בטמפרטורת חדר. הסר את הפתרון מהצלחת ולשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם DH 2 O. לאפשר לאוויר יבש. הוספת Laminin (5 מ"ג / מיליליטר בDMEM הקר: F12) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. הסר את Laminin וגם להשתמש בצלחות מייד או לאחסן בLaminin ב-20 ° C עד צורך. הכן טפטפות המלוטשת אש עם "בינוני" ומשעממים "קטן" על ידי החלפת טפטפות פסטר זכוכית בלהבה עד הקצוות להיות מעוגלים. החיטוי לעקר. ביום הנתיחה, להכין את הכמות המתאימה של מדיום תרבות על ידי ערבוב עצבי בסל בינוני עם 2% B27, 1x Glutamax, 2 מ"ג / מיליליטר הפרין, 50 יחידות / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין, 20 ng / גורם מיליליטר מטוהר צמיחת אפידרמיס כיתה קולטן עכבר (EGF), ו20 ng / מיליליטר גורם רקומביננטי צמיחת פיברובלסטים שור (FGF-2). לחמם את מדיום תרבות 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. לניתוק SVZ, להכין 0.05% טריפסין-EDTA ו0.125 מ"ג / מיליליטר טריפסין מעכב המכיל 0.01 מ"ג / מיליליטר DNaseI. לאזן את הפתרונים הללו ל37 ° C. הגדר את המיקרוסקופ לנתיחה ולהכין את הכלים הדרושים כדי להסיר את המוח (מספריים ומרית קטנה) ולSVZ וניתוחי DG (אזמל, 27 G מחט מחוברת למזרק 1 מיליליטר, # 1 x 7 מלקחיים, # x 1 5/45 מלקחיים) על ידי שריה ב70% אתנול. 2. קציר של מוח עכבר למבוגרים וMicrodissections SVZ / DG הרדימי מבוגר יחיד עכברים (8 שבועות בן) על פי ההנחיות מוסדיות המתאימות. בצע נקע בצוואר הרחם. לרסס את הראש עם 70% אתנול ללחטא את האזור ולצמצם את כמות הפרווה שdheres למספריים והמוח. באמצעות מספריים חדים לערוף את בעלי החיים בבסיס של גזע המוח. מחזיק את הראש בבסיס הגולגולת, לחתוך את הגולגולת בין שתי נורות חוש הריח על ידי הנחת להב אחד מספריים קטנים לתוך כל חלל העין וחיתוך coronally. בשלב הבא, לעשות שני חתכים לרוחב בבסיס הגולגולת, ואחריו חתך אורכי דרך הגולגולת לאורך תפר sagittal זהירות:. להבטיח את הזווית של המספריים היא רדודה ככל האפשר כדי למנוע נזק למוח הבסיסי. לחשוף את המוח על ידי לקלף את הגולגולת עם או הלהב של המספריים או זוג מלקחיים מעוקלים. לשחרר את המוח מהגולגולת בעזרת מרית קטנה ומקום לPBS הקר. יש לשטוף את המוח עם PBS להסיר דם ופרווה. העבר את המוח בצלחת פטרי 10 פלסטיק סנטימטר המכילה PBS מניחים צלחת פטרי המכילה את המוח תחת מיקרוסקופ לנתח בהגדלה נמוכה ולמקם את brain על פני השטח הגחון שלה. באמצעות מלקחיים מעוקלים בסדר להסיר את נורות חוש הריח בזמן שמחזיק את המוח במצב על ידי המוח הקטן. סובב את המוח על ההיבט הגבי ובאמצעות אזמל לעשות חתך העטרה דרך המוח ברמה של תצלובת הראייה לmicrodissect SVZ (לקבלת הוראות מפורטות יותר, ראה גם אזרי ואח'. 10), הנח את החלק מקורי של המוח, כך שעל פני השטח העטרה לחתוך פונה כלפי מעלה ולמקד את המיקרוסקופ על ההגדלה גבוהה יותר. להסיר ולסלק את המחיצה באמצעות מלקחיים מעוקלים בסדר. לנתח את SVZ (השכבה דקה של רקמה המקיפה את החדר) על ידי הצבת קצה להב אחד של זוג מלקחיים מעוקלים בסדר בפינה הצדדית של החדר לרוחב באופן מיידי מתחת לכפיס מוח והאחר כ 1 מ"מ לתוך הרקמה באופן מיידי בצמוד לחדר. לחץ כלפי מטה את המלקחיים לכיוון הבסיס של המנה וכלפי היבט הגחון של ventricle להסיר פיסה משולשת קטנה של רקמה. הנח את SVZ גזור לתוך צלחת פטרי על קרח. לmicrodissect DG (לקבלת הוראות מפורטות יותר, ראה גם Hagihara et al. 11), הנח את חלק הזנב של המוח בצלחת פטרי ולחתוך לאורך סדק אורכי באמצעות אזמל. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להסיר את המוח הקטן וdiencephalon באמצעות מלקחיים. ולמקד את המיקרוסקופ, כך שהגבולות סביב DG כעת נראים לעין. כדי להסיר הרכס משוננת, הכנס את קצה מחט 27 G ושקופיות לאורך הגבול בין DG והקרן של עמון. שימוש במלקחיים בסדר, לשחרר את DG מהרקמה הסובבת. 3. דיסוציאציה רקמות SVZ לרכך את הרקמה באמצעות להב סכין מנתחים לכ 1 דק 'עד שלא יישארו חתיכות גדולות. העברת הרקמה הטחון לצינור 15 מיליליטר באמצעות 1 מיליליטר של 0.05% prewarmed טריפסין-EDTA ו דגירה במשך 7 דקות באמבט מים מוגדר 37 ° C. כדי לעצור את התגובה האנזימטית, להוסיף 1 מיליליטר של מעכבי טריפסין המכילים DNaseI ומערבבים את התוכן על ידי מצליף את הצינור. גלולה ההשעיה על ידי צנטריפוגה XG 300 5 דקות וזורקים supernatant Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של מדיום גידול ולנתק בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה כ 7-10x באמצעות פיפטה P1000 זהירות:. מעל triturating יכול להוביל למוות של תאים גדלו ויהיה להשפיע לרעה על צמיחת תאים שלאחר מכן. הוסף בינוני צמיחה להיקף כולל של 5 מ"ל ולהעביר את ההשעיה התא דרך מסננת 40 מ"מ כדי להסיר שאריות וגושי רקמת undissociated. צנטריפוגה XG 300 5 דקות, לבטל את supernatant ו resuspend את הכדור וכתוצאה מכך 200 בינוני מיליליטר צמיחה. 4. דיסוציאציה רקמות DG לרכך את הרקמה באמצעות להב סכין מנתחים לכ 1 דק 'עד שלא יישארו חתיכות גדולות והעברהלתערובת אנזים PDD prewarmed (פפאין 2.5 U / ml, Dispase U / ml 1, DNaseI 250 U / ml). דגירה עבור 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס, ערבוב על ידי צינור היפוך כל דקות 3-5. לנתק את הרקמה באופן מכאני באמצעות משעמם בינוני, אש מלוטשת, פיפטה פסטר על ידי pipetting למעלה ולמטה בעדינות 10x. דגירה נוספת 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס, ערבוב על ידי צינור היפוך כל דקות 3-5. בהמשך לנתק את הרקמה באופן מכאני באמצעות שעם קטן, אש מלוטשת פיפטה פסטר על ידי pipetting למעלה ולמטה בעדינות 10x. צנטריפוגה ב XG 130 למשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הכדור בפתרון חיץ מיליליטר 1 (1x HBSS, 30 מ"מ גלוקוז, 2 HEPES מ"מ (pH 7.4), 26 מ"מ NaHCO 3). הפוך עד 10 מיליליטר עם פתרון חיץ. צנטריפוגה ב XG 130 למשך 5 דקות. הסר supernatant ו resuspend את הכדור ב 5 מיליליטר של 20% Percoll. (כדי להכין 90% Percoll, להוסיף 4.5 מיליליטר של 100% Percoll ל0.5 מיליליטר של 10x PBS אז לדלל עוד יותר זה ל20% על ידי הוספת 1.1 מיליליטר 90% Percoll ל3.9 מיליליטר 1x PBS). צנטריפוגה 450 XG במשך 15 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 10 חיץ מיליליטר. צנטריפוגה ב XG 130 למשך 5 דקות. Resuspend את הכדור ב200 מדיום גידול μl. 5. דור של תרבויות חסיד חד שכבתי פלייט SVZ הניתק או רקמות DG לPDL / Laminin אחת מצופה גם צלחת 96 היטב ולדגור על 37 ° C עם 5% CO 2. כ 24 שעות לאחר ציפוי, ברגע שהתאים יש דבק למשטח המצופה, להחליף את מדיום הגידול כדי להסיר את עודפי פסולת נוסף. כל 3-4 ימים שלאחר מכן, מחצית חליפין של מדיום הגידול במדיום חדש כדי לחדש את גורמי הגדילה. חזור על פעולה עד שהתאים מגיעים confluency כ 80% והם מוכנים להיות passaged הערה:. הזמן בין ציפוי והקטע הראשון יכול לקחת עד 2-3 שבועות. <p class = "jove_title"> 6. Passaging של תרבויות חסיד חד שכבתי כאשר התרבויות להגיע confluency כ 80% להסיר את המדיום מהבאר ולשטוף עם PBS. שים לב: אין לאפשר לתאים יעלו confluency 90% כמו זה יכול להוביל לניתוק של תאים והיווצרות neurosphere ובנוסף, רמות גבוהות של מוות של תאים. הוסף 50 מיליליטר Accutase ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות (לבדוק אם התאים מעוגלים ומנותקים). הסר את תאי צינור 15 מ"ל ולשטוף היטב פעם עם PBS ולהעביר לאותו צינור. לדלל תאים עד 5 מיליליטר עם PBS ו צנטריפוגות XG 300 למשך 5 דקות. למעבר הראשון, לדלל תאים למיליליטר 1 וצלחת לתוך PDL / Laminin המצופה היטב של צלחת גם 24. לקטעים שלאחר מכן, תאי resuspend ב 200 מיליליטר מדיום גידול וספירה באמצעות hemocytometer. צלחת ב 1 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר ובגודל המתאים מצופה או בקבוק. </l i> 7. בידול של תרבויות חסיד חד שכבתי כדי לבדל תרבויות monolayer חסיד, תאי צלחת מתרבות על coverslips המצופה PDL / Laminin בצפיפות של 1 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר במדיום גידול המכיל 20 ng / ml EGF ו10 bFGF ng / ml. כאשר התאים מגיעים confluency כ 80% (בדרך כלל 2 ימים), החלף את מדיום הגידול במדיום המכיל bFGF 5 ng / ml ו0 ng / ml EGF. בעקבות 2 ימים ב5 ng / ml bFGF, להחליף את המדיום עם מדיום גידול בהיעדרם של שתי mitogens לעוד 3 ימים הערה:. בתקופה זו כמות משמעותית של מוות של תאים תתרחש. לאחר סך של 5 ימים, לשטוף את התאים מובחנים עם PBS להסיר את כל תאים מתים ואז לתקן עם paraformaldehyde 4% (PFA) עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר. שטוף שוב עם PBS להסיר כל coverslips PFA והחנות בבארות ב1 מיליליטר PBS ב 4 ° C. jove_title "> 8. neurosphere תרבות וכימות לדלל את SVZ הניתק או רקמות DG מחיה אחת ב20 מיליליטר של מדיום התרבות וצלחת 200 מיליליטר / היטב על פני צלחת 96 היטב באמצעות פיפטה multidoser 10 מיליליטר. לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 6-7 ימים לneurospheres נגזרת SVZ ו10-12 ימים לneurospheres נגזרה-DG. הערה: צמיחה למשך זמן ארוך יותר מאשר פעמים דגירה המומלצת אלה תגרום לצמיחת יתר ותביא למותם של תאים במרכז neurospheres ו / או, הקובץ המצורף והתמיינות ספונטניים. לספור ולמדוד את הקוטר של neurospheres באמצעות מצויד למיקרוסקופ אור הזקופה graticule עינית 9. Passaging neurospheres לאחר neurospheres העיקרית נספרו והגודל שלהם נרשם שהם יכולים להיות מורחבים על פני כמה קטעים מתחילים עם או neurosphere בודד או תרבות בתפזורת. הרחבת neurosphere התרבות גורפת לneurospheres שילוב מעבר כתרבות בתפזורת, הסר את המדיום המכיל neurospheres מהצלחת, להעביר לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 300 למשך 5 דקות. בטל supernatant ו resuspend neurospheres ב 1 מיליליטר של 0.05% prewarmed טריפסין-EDTA ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות. הוסף נפח שווה של מעכבי טריפסין המכילים DNaseI ומערבבים היטב. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב300 XG, להסיר את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר של מדיום גידול. Triturate למעלה ולמטה כ 10x עם טפטפת P1000 לנתק neurospheres. הסר 10 מיליליטר של ההשעיה התא ומערבבים עם נפח שווה של trypan כחול ולבצע ספירת תאים חי באמצעות hemocytometer. לזרוע תאים בצפיפות של 1 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר בתרבות המתאימה בגודל התא טוב או בקבוק. דגירה על 37 מעלות צלזיוסעם 5% CO 2 עד טופס neurospheres המשנית. הרחבת neurosphere יחידה למעבר neurospheres פרט לבחור בארות המכילות neurosphere אחד ולהסיר בזהירות וזורקים כ 160 μl של מדיום גידול מכל אחד גם מבלי להפריע neurosphere. הוספה של 0.05% טריפסין-EDTA 100 מיליליטר לכל טוב שיש passaged ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות. הוספה של טריפסין 100 μl מעכב המכיל DNAseI כדי לעצור את התגובה. Triturate כ 10 פעמים למעלה ולמטה עם טפטפת P200 להתפרק neurosphere. העבר מיליליטר 200 מכיל neurosphere ניתק לבאר חדשה של צלחת 24 גם מכילה 1.5 מיליליטר של מדיום גידול. לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 עד טופס neurospheres המשנית. הערה: כדי לקבוע את פוטנציאל לטווח ארוך, אחד המאפיינים העיקריים של ים עצבי אמיתיתא TEM, neurospheres יש passaged לפחות 5-10 מעברים. ראה גם הספרות העוסק בפרשנות השנויה במחלוקת של חלק בתוצאות כאלה 12-14. 10. בידול של תרבויות neurosphere יכולה להיות מובחנת neurospheres הראשונית או passaged לקבוע multipotentiality. הסר neurospheres בהשעיה מצלחת התרבות או הבקבוק שלהם ולהעביר אותם לצלחת פטרי 10 פלסטיק סנטימטר. תחת מיקרוסקופ לנתיחה להסיר כ 15-20 neurospheres מהמדיום באמצעות פיפטה P20 ולהעביר לצלחת 24 גם מכילה את מדיום התרבות ללא גורמי גדילה וcoverslip מצופה PDL / Laminin. להבדיל לכ 7 ימים ב37 ° C עם 5% CO 2. שטוף את neurospheres הבדיל עם PBS להסיר את כל תאים מתים ואז לתקן עם PFA 4% עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר. שטוף שוב עם PBS לrסר כל coverslips PFA והחנות בבארות ב1 מיליליטר PBS ב 4 ° C 11. Immunostaining של neurosphere ותרבויות חסיד הערה: לצביעה עם נוגדן O4 להשמיט את טריטון מצעדי החסימה וצביעה וזכור להשתמש בשני נוגדנים IgM מתאימים. דגירה coverslips מכיל neurospheres הבדיל או תרבויות monolayer חסיד בחסימת פתרון (10% דונקי סרום רגיל בPBS המכיל 0.2% טריטון X-100) ל60 דקות בטמפרטורת חדר. דגירה בפתרון חסימה טרי המכיל bIII-טובולין הראשוני, Map2a + b, חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) או נוגדני O4 ל60min בטמפרטורת חדר. לשטוף 3x עם PBS. דגירה בפתרון חסימה טרי המכיל נוגדנים מתאימים הקרינה מצומדות משניים ו4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1:5,000) ל30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. <li> לשטוף שלוש פעמים עם PBS. הר coverslips על גבי שקופיות מיקרוסקופ באמצעות יבש בינונית ואוויר הרכבה הקרינה בלילה החשוך צפה בתמונה ובאמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.