Un ratón, dos culturas: Aislamiento y cultivo de adultos Neural las células madre de las dos zonas neurogénicos de ratones individuales

1. Configuración básica y preparación del medio de cultivo Al menos dos días antes de comenzar el experimento, la preparación de poli-D-lisina (PDL) / laminina revestida de placas de cultivos monocapa adherentes. Para preparar pozo / frascos añadir suficiente PDL (10 mg / ml en dH 2 O) para cubrir la superficie e incubar durante la noche a temperatura ambiente. Eliminar la solución de la antena y lavar el plato tres veces con dH 2 O. Deje que se seque al aire. Añadir laminina (5 mg / ml en DMEM frío: F12) y se incuba a 37 ° C durante la noche. Retire la laminina y, o bien utilizar las placas de inmediato o guarde con la laminina a -20 ° C hasta su utilización. Preparar pipetas pulido fuego con agujeros "pequeños" "medio" y girando pipetas Pasteur de vidrio en una llama hasta que los bordes se redondean. Esterilizar en autoclave para esterilizar. En el día de la disección, preparar la cantidad apropiada de medio de cultivo por mezcla de los nervios medio basal con 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg / ml de heparina, 50 unidades / ml de penicilina / estreptomicina, 20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico receptor purificado grado de ratón (EGF), y 20 ng / factor de crecimiento de fibroblastos bovina recombinante ml (FGF-2). Calentar el medio de cultivo a 37 ° C en un baño de agua. Para la disociación ZVS, preparar 0,05% de tripsina-EDTA y 0,125 mg / ml de inhibidor de la tripsina que contiene 0,01 mg / ml de ADNasa I. Equilibrar estas soluciones a 37 ° C. Establecer un microscopio de disección y preparar las herramientas necesarias para extraer el cerebro (tijeras y espátula pequeña) y para ZVS y la Dirección General de disecciones (bisturí, 27 G aguja unida a una jeringa de 1 ml, 1 x # 7 pinzas, 1 x # 5/45 fórceps) por inmersión en etanol al 70%. 2. La recolección de los cerebros de ratones adultos y SVZ / DG microdisecciones Anestesie adulto soltero (8 semanas de edad) los ratones de acuerdo con las directrices institucionales apropiados. Realice dislocación cervical. Pulverizar la cabeza con etanol al 70% para esterilizar el área y para reducir al mínimo la cantidad de piel que unadHères a las tijeras y el cerebro. Utilizando unas tijeras afiladas decapitar al animal en la base del tronco cerebral. Sostener la cabeza en la base del cráneo, cortar el cráneo entre los dos bulbos olfatorios colocando una hoja de un pequeño par de tijeras en cada cavidad de los ojos y el corte coronal. A continuación, hacer dos cortes laterales en la base del cráneo, seguido de un corte longitudinal a través del cráneo largo de la sutura sagital Precaución:. Aseguran el ángulo de la tijera es lo más planas posible para evitar daños en el cerebro subyacente. Exponer el cerebro, quitando el cráneo, ya sea con la hoja de la tijera o un par de pinzas curvas. Libere el cerebro del cráneo siguiendo una pequeña espátula y el lugar en PBS frío. Enjuague cerebros con PBS para eliminar la sangre y la piel. Transferencia cerebros para una placa de Petri de 10 cm de plástico que contenía PBS Coloque el plato de Petri que contiene el cerebro con un microscopio de disección a bajo aumento y posicionar el brain en su superficie ventral. Usando pinzas curvas finas eliminar los bulbos olfativos mientras mantiene el cerebro en posición por el cerebelo. Girar el cerebro en la cara dorsal y el uso de un bisturí hacer un corte coronal a través del cerebro a nivel del quiasma óptico Para microdissect la ZVS (para obtener instrucciones más detalladas, consulta Azari et al. 10), colocar la porción rostral del cerebro de manera que la superficie coronal cortar quede hacia arriba y enfocar el microscopio en un aumento mayor. Retire y deseche el tabique usando pinzas curvas finas. Diseccionar la SVZ (la capa delgada de tejido que rodea el ventrículo) mediante la colocación de la punta de una hoja de un par de pinzas curvas finas en la esquina lateral del ventrículo lateral inmediatamente debajo del cuerpo calloso y los otros aproximadamente 1 mm en el tejido inmediatamente adyacente al ventrículo. Presione hacia abajo la pinza hacia la base del plato y hacia la cara ventral del ventrArticulo para quitar una pequeña pieza triangular de tejido. Coloque la SVZ disecado en una placa de Petri en hielo. Para microdissect la DG (para obtener instrucciones más detalladas, consulta Hagihara et al. 11), colocar la porción caudal del cerebro en la placa de Petri y cortar a lo largo de la fisura longitudinal con un bisturí. Bajo un microscopio de disección, retire el cerebelo y el diencéfalo uso de fórceps. Reorientar el microscopio para que los bordes alrededor de la DG son ahora visibles. Para quitar el giro dentado, introduzca la punta de una aguja 27 G y se deslizan a lo largo de la frontera entre el Director General y el cuerno de Ammon. Usando las pinzas finas, liberar a la Dirección General de los tejidos circundantes. 3. La disociación de tejidos SVZ Picar el tejido usando una hoja de bisturí durante aproximadamente 1 min hasta que no hay piezas grandes permanecen. Transferir el tejido picado a un tubo de 15 ml usando 1 ml de precalentado 0,05% de tripsina-EDTA y se incuba durante 7 min enun baño de agua ajustado a 37 ° C. Para detener la reacción enzimática, añadir 1 ml de inhibidor de tripsina que contiene DNaseI y mezclar el contenido colocando el tubo. Pellet la suspensión por centrifugación a 300 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante Resuspender el precipitado en 1 ml de medio de cultivo y se disocian pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo de aproximadamente 7 a 10 veces con una pipeta P1000 Precaución:. Sobre trituración puede conducir a un aumento de la muerte celular y tendrá un impacto negativo sobre el crecimiento celular subsiguiente. Añadir medio de crecimiento a un volumen total de 5 ml y pasar la suspensión celular a través de un tamiz de 40 mm para eliminar los residuos y grumos de tejido no disociadas. Centrifugar a 300 xg durante 5 min, descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento resultante en 200 ml de medio de crecimiento. 4. DG Tissue Disociación Picar el tejido usando una hoja de bisturí durante aproximadamente 1 min hasta que no hay piezas grandes permanecen y la transferenciaen precalentado mezcla de enzimas PDD (Papaína 2,5 U / ml de dispasa, 1 U / ml de ADNasa I, 250 U / ml). Incubar durante 20 min a 37 ° C, la mezcla invirtiendo el tubo cada 3-5 minutos. Disociar el tejido mecánicamente usando un calibre medio, el fuego pulido pipeta Pasteur de la pipeta hacia arriba y hacia abajo suavemente 10 veces. Incubar durante otros 10 min a 37 ° C, la mezcla invirtiendo el tubo cada 3-5 minutos. Además disociar el tejido mecánicamente usando un pequeño orificio, fuego pulido pipeta Pasteur de la pipeta hacia arriba y hacia abajo suavemente 10 veces. Se centrifuga a 130 × g durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de solución tampón (1x HBSS, 30 mM de glucosa, 2 mM de HEPES (pH 7,4), 26 mM NaHCO 3). Completar hasta 10 ml con solución tampón. Se centrifuga a 130 × g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 5 ml de 20% de Percoll. (Para preparar 90% de Percoll, añadir 4,5 ml de 100% de Percoll a 0,5 ml de 10x de PBS y después se diluye aún más esta a 20%mediante la adición de 1,1 ml de 90% de Percoll a 3,9 ml de 1x PBS). Centrifugar 450 xg durante 15 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de tampón. Se centrifuga a 130 × g durante 5 min. Resuspender el sedimento en 200 l medio de crecimiento. 5. Generación de cultivos adherentes monocapa Placa de la ZVS disociada o tejido DG en un único PDL / laminina revestida pocillo de una placa de 96 pocillos y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2. Aproximadamente 24 horas después de la siembra, una vez que las células se han adherido a la superficie revestida, intercambiar el medio de crecimiento para eliminar adicionalmente el exceso de desechos. Cada posteriores 3-4 días, el intercambio de medio del medio de cultivo con medio fresco para reponer los factores de crecimiento. Repita hasta que las células alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia y están listos para ser pasados ​​Nota:. El tiempo entre las planchas y el primer paso puede tomar hasta 2-3 semanas. <pclass = "jove_title"> 6. El pase de cultivos adherentes monocapa Cuando los cultivos alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia eliminar el medio del pozo y lavar con PBS. Nota: No permita que las células se exceden 90% de confluencia, ya que esto puede conducir a la separación de las células y la formación de neuroesfera y, además, el aumento de los niveles de muerte celular. Añadir 50 ml Accutase y se incuba a 37 ° C durante 2-3 min (comprobación para ver si las células son redondas y distante). Retire las células a un tubo de 15 ml y lavar el bien una vez con PBS y transferir al mismo tubo. Diluir las células a 5 ml con PBS y centrifugar 300 xg durante 5 min. Para el primer pasaje, diluir las células a 1 ml y la placa en una PDL / laminina recubierto pocillo de una placa de 24 pocillos. Para pasos subsiguientes, volver a suspender las células en 200 ml de medio de crecimiento y el recuento utilizando un hemocitómetro. Placa a 1 x 10 4 células / cm 2 en el que esté bien cubierto de tamaño apropiado o frasco. </l i> 7. La diferenciación de cultivos adherentes monocapa Para diferenciar los cultivos monocapa adherentes, la placa de la proliferación de células en PDL / cubreobjetos recubiertos de laminina a una densidad de 1 x 10 4 células / cm 2 en medio de crecimiento que contiene 20 ng / ml de EGF y 10 ng ml de bFGF /. Cuando las células alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia (generalmente 2 días), sustituir el medio de cultivo con medio que contiene 5 ng / ml de bFGF y 0 ng / ml de EGF. Después de 2 días en 5 ng / ml de bFGF, sustituir el medio con medio de crecimiento en ausencia de ambos mitógenos durante otros 3 días Nota:. Durante este período se produzca una cantidad significativa de la muerte celular. Después de un total de 5 días, se lavan las células diferenciadas con PBS para eliminar cualquier célula muerta luego fijar con 4% de paraformaldehído (PFA) durante 20 min a temperatura ambiente. Lavar a continuación con PBS para eliminar cualquier cubreobjetos PFA y almacenar en pozos en 1 ml de PBS a 4 ° C. jove_title "> 8. Neurosphere Cultura y Cuantificación Diluir la SVZ disociada o tejido DG de un animal en 20 ml de medio de cultivo y la placa 200 ml / pocillo en una placa de 96 pocillos usando una pipeta de 10 ml multidoser. Se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 6-7 días para neuroesferas derivadas de SVZ y 10-12 días para neuroesferas derivadas de la DG. Nota: el crecimiento durante más de estos tiempos de incubación recomendados resultará en el crecimiento excesivo y dará lugar a la muerte celular en el centro de las neuroesferas y / o, apego espontáneo y la diferenciación. Contar y medir el diámetro de las neuroesferas usando una retícula ocular montado en un microscopio de luz en posición vertical 9. Pasar las neuroesferas Después de las neuroesferas primarias han sido contados y su tamaño grabado que se puede ampliar a través de varios pasajes que comienzan con un único neuroesfera o un cultivo en masa. Bulk expansión cultura neuroesfera Para paso neuroesferas combinados como un cultivo en masa, retire el medio que contiene las neuroesferas de la placa, transferir a un tubo de 15 ml y centrifugar a 300 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las neuroesferas en 1 ml de precalentado 0,05% de tripsina-EDTA y se incuba a temperatura ambiente durante 3 min. Añadir un volumen igual de inhibidor de tripsina que contiene DNaseI y mezclar bien. Centrifugar durante 5 min a 300 xg, eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de medio de crecimiento. Triturar arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces con una pipeta P1000 para disociar las neuroesferas. Eliminar 10 ml de la suspensión celular y se mezclan con un volumen igual de azul de tripano y realizar un recuento de células vivas utilizando un hemocitómetro. Resiembre las células a una densidad de 1 x 10 4 células / cm 2 en el cultivo de células de tamaño adecuado o bien matraz. Incubar a 37 ° Ccon 5% de CO 2 hasta que se formen neuroesferas secundarias. Expansión individual neuroesfera Para pasaje neuroesferas individuales eligen pozos que contienen un único neuroesfera y retirar con cuidado y descartan aproximadamente 160 l de medio de crecimiento de cada pocillo sin alterar la neuroesfera. Añadir 100 ml de 0,05% de tripsina-EDTA a cada pocillo para ser pasado y se incuba a temperatura ambiente durante 3 min. Añadir 100 l de inhibidor de la tripsina que contiene DNAseI para detener la reacción. Triturar aproximadamente 10 veces arriba y abajo con una pipeta P200 para romper el neuroesfera. Transferir los 200 ml que contiene la neuroesfera disociada a un nuevo pocillo de una placa de 24 pocillos que contenía 1,5 ml de medio de crecimiento. Se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 hasta que se formen neuroesferas secundarias. Nota: para determinar el potencial a largo plazo, una de las propiedades cardinales de un verdadero s neuronalescélula TEM, neuroesferas debe ser pasado por lo menos 5 a 10 pasajes. Véase también la bibliografía sobre el controvertido papel en la interpretación de estos resultados 12-14. 10. La diferenciación de las Culturas Neurosphere Neuroesferas primarias o con pases pueden ser diferenciados para determinar multipotencialidad. Retire neuroesferas en la suspensión de su placa de cultivo o frasco y transferirlos a un 10 cm placa Petri de plástico. Bajo un microscopio de disección eliminar aproximadamente 15-20 neuroesferas a partir del medio utilizando una pipeta P20 y transferir a una placa de 24 pocillos que contenía medio de cultivo sin factores de crecimiento y un cubreobjetos recubiertos PDL / laminina. Diferenciar por aproximadamente 7 días a 37 ° C con 5% de CO 2. Lavar las neuroesferas diferenciados con PBS para eliminar cualquier célula muerta luego fijar con PFA al 4% durante 20 min a temperatura ambiente. Lavar a continuación con PBS para rquítelo cualquier cubreobjetos PFA y almacenar en pozos en 1 ml de PBS a 4 ° C 11. La inmunotinción de Neurosphere y cultivos adherentes Nota: Para la tinción con el anticuerpo O4 omitir el Tritón de las etapas de bloqueo y de tinción y recuerde usar un anticuerpo secundario IgM apropiado. Incubar los cubreobjetos que contienen las neuroesferas diferenciados o cultivos monocapa adherentes en solución de bloqueo (10% de suero normal de burro en PBS que contenía 0,2% de Triton X-100) durante 60 min a temperatura ambiente. Incubar en solución de bloqueo fresco que contiene bIII-tubulina primaria, Map2a + B, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) o anticuerpos O4 para 60min a temperatura ambiente. Lavar 3 veces con PBS. Incubar en solución de bloqueo fresco que contiene de fluorescencia anticuerpos secundarios conjugados apropiados y 4,6-diamino-2-fenilindol (DAPI; 1:5.000) durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. <li> lavar tres veces con PBS. Montar los cubreobjetos en portaobjetos de microscopio de fluorescencia utilizando el montaje mediano y aire seco en la oscuridad durante la noche Ver e imagen usando un microscopio de fluorescencia.