In vitro Indagine della MexAB Efflux pompa da Pseudomonas aeruginosa

1. Proteine ​​produzione e purificazione MEXA, MexB da Pseudomonas aeruginosa Trasforma i plasmidi che ospitano i geni MEXA e MexB in E. coli ceppo di produzione (ad esempio C43 DE3). Piatto su LB Agar supplementato con l'antibiotico appropriato. Scegli una singola colonia per inoculare un precoltura O / N. La mattina dopo, inoculare il precoltura in 1 L di LB e di crescere a 37 ° C sotto agitazione (240 rpm). Una volta che le cellule hanno raggiunto la fase esponenziale (OD 600 = 0,6-0,8) inducono con 1 mM IPTG. Eseguire di induzione per 2-3 ore a 30 ° C sotto agitazione. Centrifugare le cellule (9.000 xg per 20 min) e risospendere in 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mm. Distruggere le cellule utilizzando una pressa francese (10.000 psi, 4 pass). Eliminare le celle continue e corpi di inclusione per centrifugazione a 9.000 xg per 20 min. Membrane pellet 1 ora a 100.000 xg e resuspend ciascun pellet in 30 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 20% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM. Determinare la concentrazione totale di proteine ​​di membrana utilizzando il saggio colorimetrico BCA e solubilizzare le membrane O / N con 2% maltoside dodecil (DDM) in un volume finale determinata in modo tale detergente: proteina è 1:1,5 (w / w). Ultracentrifuga a 100.000 xg per 1 ora di disfarsi del materiale non solubilizzato e aggregati. Incubare il supernatante per 2 ore a 4 ° C con una resina al nichel (Mexa purificazione) o una resina di cobalto (MexB purificazione) equilibrata con Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 5% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mm, DDM 0,2%. Versare la resina in una colonna vuota. Raccogliere il flusso attraverso. Lavare la resina con 50 ml di Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 20% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%, poi con 25 ml di Bis-Tris 10 mM pH 6, glicerolo 5% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM. Eluire il protein con 20 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 5% (w / v), imidazolo 300 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM. Concentrare la proteina di un dispositivo di ultrafiltrazione fino a 3 ml e il carico su una colonna dissalazione equilibrata con un buffer libero-imidazolo. Poco prima di ricostituzione (vedi sotto), Ultracentrifuge le proteine ​​solubilizzate (100.000 xg per 20 min) per sbarazzarsi di lipidi e proteine ​​unsolubilized. Poi ancora alla concentrazione della proteina di 0,3 ml. Batteriorodopsina da Halobacter Salinarium Crescere le cellule Salinarium Halobacter sotto illuminazione a 37 ° C per 10 giorni in un mezzo di crescita liquido contenente NaCl 4 M, MgSO4 150 mM, citrato 10 mM, KCl 30 mM, estratto di lievito 5 g / L, e peptone 5 g / L. Distruggere le cellule da dialisi contro acqua deionizzata. Purificare la membrana viola su un 30-40% (w / v) gradiente di saccarosio (100.000 xg per 17 hr). Solubilizzare la sospensione membrana con 2% octylglucoside per 24 ore a 37 ° C (volume per la solubilizzazione per risospendere membrana a 2:1 (w / w) di detergenti: rapporto di proteina). Stimare la concentrazione di BR solubilizzato con ε (570 nm) = 54.000 M -1 cm -1. Poco prima di ricostituzione (vedi sotto), Ultracentrifuge BR solubilizzato (100.000 xg per 20 min) per sbarazzarsi di lipidi e proteine ​​unsolubilized. Nota: Le membrane native sono naturalmente arricchite in BR quindi non è necessario ulteriore purificazione. 2. Preparazione di proteoliposomi Formazione di liposomi: Mettere 400 ml di DOPC disciolti in cloroformio (25 mg / ml) in un bicchiere di vetro e aggiungere 1,5 mg di colesterolo memorizzato come polvere. Asciugarle appena prima manipolazione sotto un vapore di azoto o sotto vuoto per almeno 1 ora in un bicchiere di vetro. Il DOPC: rapporto molare colesterolo è 3.3:1. Dopo che si sono asciugati, idratare i lipidi di 1 ml di HEPES 25 mM pH 7,K 2 SO 4 100 mM, MgCl 2 2 mM, 2 mM pyranine. La sospensione dovrebbe apparire torbida in questa fase. Riscaldare la soluzione per 10 minuti a 37 ° C. Ultrasuoni per 10 min a 40 W con 30 sec impulsi, 30 cicli di pausa sec a RT. La sospensione dovrebbe apparire chiaro in questa fase. Per ottenere una popolazione monodisperse di liposomi, eseguire due cicli di estrusione e per ogni ciclo, passare la sospensione di liposomi attraverso il filtro almeno 11x. Per il primo ciclo, utilizzare una dimensione dei pori di membrana di 200 nm e per il secondo ciclo, utilizzare una dimensione dei pori di membrana di 100 nm. Misure di scattering di luce dinamici possono essere eseguite in questa fase per verificare l'omogeneità della sospensione. Proteine ​​incorporazione Principio: membrana proteine ​​possono essere ricostituiti in liposomi per effetto solubilizzante dei detergenti. Liposomi detergente-solubilizzati vengono incubati con la proteina di membrana detergente-solubilizzato e formazione del proteoliposomes è innescato da una rapida eliminazione del detergente con perle di polistirene 9. Aggiungere 28 mg di Triton X-100 (0,56% finale) e incubare O / N a 4 ° C (la temperatura di solubilizzazione può essere adattato alla proteina studiata). Aggiungere il detersivo proteina-solubilizzato (BR, MexB e Mexa) ai liposomi solubilizzate e incubare 15 min a 4 ° C. Aggiungere le proteine ​​per la sospensione di liposomi solubilizzato i seguenti rapporti (w / w): lipidi / MexB = 20, MexB / MEXA = 2.5, e lipidi / BR = 30. Aggiungere perle di polistirene ad un 30:1 branelli: rapporto detergente (w / w, considerando il peso totale di detersivo, compreso detersivo aggiunto con le proteine ​​purificate) e incubare 5 ore, al buio (a causa della BR) a temperatura ambiente sotto leggera mescolando. Prima di questa procedura, attivare i biobeads con metanolo ed etanolo incubazione e ampiamente lavare con acqua. Purificare la proteina proteoliposomi e substrati gratuitamente utilizzando un PD-10colonna dissalazione equilibrata con HEPES pH 25 mM 7, K 2 SO 4 e 100 mM MgCl 2 2 mM. Conservare le proteoliposomi a 18 ° C al buio per un massimo di 2-3 settimane. Valutazione dell'efficacia ricostituzione su gradiente di saccarosio. Per controllare che sia il MexB e BR sono stati ricostituiti in liposomi, purificare la sospensione proteoliposome su un gradiente di saccarosio discontinuo. Depositarsi delicatamente i proteoliposomi su un gradiente cinque strati di saccarosio (60%, 20%, 10%, 5% e 2,5%, w / v). Ultracentrifuga per 17 ore a 100.000 xg (con l'accelerazione minima e decelerazione). Raccogliere accuratamente le varie frazioni gradiente (in particolare le interfacce tra ogni strato di saccarosio) e analizzarli su SDS-PAGE (10%) con Coomassie colorazione o Western blotting. Proteine ​​aggregate si trovano nella parte inferiore del tubo, mentre, proteine ​​detergenti-solubilizzato nonincorporated si trovano nella parte superioreil tubo. Proteoliposomi e liposomi sono disponibili all'indirizzo interfacce saccarosio corrispondenti alla loro densità intrinseca. Liposomi vuoti sono recuperate più in alto nel gradiente rispetto alle proteoliposomi. 3. Fluorescenza di misura Effettuare misure di fluorescenza a 25,0 ° C usando un spettrofluorimetro consentendo misure a doppia lunghezza d'onda (lampada Xe, 150 W). Periodi di illuminazione alternativi (per attivare BR con lunghezze d'onda di eccitazione / emissione di 550 nm / 550 nm) e misure di fluorescenza con lunghezze d'onda di eccitazione / emissione di 455 nm / 509 nm per 2 secondi per misurare la fluorescenza pyranine. Impostare eccitazione e di emissione larghezze di banda di 5 nm. Effettuare le misure in presenza di 50 nM valinomicina per impedire la formazione di un potenziale di membrana ΔΨ inverso. Nota: Infatti, poiché il BR pompe protoni, ci sono più cariche positive all'interno del liposoma che all'esterno. Questa caricagradiente può essere eliminata utilizzando valinomicina, che è un K + ionoforo selettiva. Una volta aggiunto alla valinomicina liposomi sospensione, come una molecola idrofobica, inserirà nella membrana del liposoma, passivamente trasportare K +, e quindi dissipare il potenziale ΔΨ membrana.