במבחנה של החקירה וMexAB זרימת המשאבה מPseudomonas aeruginosa
Summary
אנו מציגים פרוטוקול לחקירה במבחנה של משאבות בזרימת מPseudomonas aeruginosa. פרוטוקול זה מאפשר לדור של שיפוע פרוטון חזק, הפיך, ומתכונן בתוך קרום יפוזום ולכן צריך להיות מותאם לכל חלבון קרום אנרגיה על ידי כוח protomotive.
Abstract
קיים צורך מדעי המתעוררים לכלים אמינים לניטור תחבורת חלבון קרום. אנו מציגים מתודולוגיה שהובילה לכינון מחדש של משאבות בזרימת מaeruginosa Pseudomonas חיידקים גראם שליליים בסביבת biomimetic המאפשר חקירה מדויקת של פעילותם של תחבורה. שלושה תנאים מוקדמים מתקיימים: מידור בסביבה lipidic, שימוש במדד רלוונטי להובלה, ודור של שיפוע פרוטון. טרנספורטר חלבון הקרום מחדש ליפוזומים יחד עם bacteriorhodopsin, משאבת פרוטון אור הופעל שיוצרת שיפוע פרוטון שהוא חזק, כמו גם הפיך ומתכונן. הפעילות של החלבון היא להסיק מוריאציות ה-pH המתרחשות בתוך יפוזום, באמצעות pyranin, בדיקה ניאון pH תלוי. אנו מתארים הליך צעד אחר צעד שבו טיהור חלבוני קרום, היווצרות יפוזום, הכינון מחדש חלבון, ותחבורהnalysis מטופלות. למרות שהם תוכננו במיוחד עבור טרנספורטר RND, השיטות המתוארות עלולות להיות מותאמות לשימוש עם כל טרנספורטר חלבון קרום אחר אנרגיה על ידי שיפוע פרוטון.
Introduction
חלבוני קרום נפרד מייצגים עד 30% מהגנים המקודדים בגנום אוקריוטים. הם חולקים בתפקידים מרכזיים כגון שמירה על שער (קולטנים), הובלת חומרים מזינים, יונים או תרכובות רעילים (מובילים) או שמירה של החדירות פני bilayers קרום (ערוצים) בין כל תאי החיים 1. בזרימת משאבות יש להם תפקיד מרכזי בהתנגדות נגד טיפול אנטיביוטי 2. בחיידקים גראם השליליים, Pseudomonas aeruginosa, אשר מוגנו על ידי קרום חיצוני, מובילי זרימה מאורגנים כמערכות משולשת שבו MexB, המשאבה בזרימת הממוקמת בקרום הפנימי, עובדת בשיתוף עם Mexa, חלבון periplasmic, וOprM, ערוץ קרום חיצוני. חלבון הקרום הפנימי cytoplasmic פועל כמשאבת אנרגיה תלויה עם סגוליות מצע רחבות. חלבון הקרום החיצוני פועל כPorin ואילו שליש נמצא בשטח periplasmic והוא חשב על מנת לייצב את המכלול השלם <sעד> 3. בחלק הבא, אנו מתמקדים בעיצוב של assay פונקציונלי להרכבת Mexa MexB.
מידע מבני נצבר במשך 5 השנים האחרונות הודות לנחישות רנטגן של AcrB החלבון הומולוגי מEscherichia coli 4-7. למרות שזה ברור שחשוב לבני זוג מידע כזה עם נתונים דינמיים והקינטית, עיצוב assay פונקציונלי לטרנספורטר הזה הוא אתגר אמיתי 8. ואכן, חלבוני הקרום חייבים להישמר בסביבה קרומית ותא סגור חייב להישמר לתחבורת וקטורים של מצע להיות מושגת.
הכינון מחדש של חלבונים בממברנה לproteoliposomes כבר הציג בהרחבה וביקורת (ראה ריגו ו9 לוי). פרוטוקולים כגון לאפשר הניטור של פעילות חלבונים בממברנה, למשל על ידי ביצוע מצעים פני קרום יפוזום. במקרה זה נובעות ממגבלותvailability של מצעי titratable (ניאון, רדיואקטיבי, וכו '.) ומן העובדה כי לעתים קרובות מאוד מצעים אלה הם הידרופובי ויש נטייה לחצות קרומים ללא קשר לנוכחות של טרנספורטר. כחלופה, אפשר לעקוב וריאציות ספקטרוסקופיות של צבע דיווח רגיש לשינויים כימיים המתרחשים כתוצאה מהובלה. כאמור לעיל, פרוטונים להמריץ תחבורה באמצעות MexB. לפיכך, אפשרות רלוונטית היא לפקח וריאציות ספקטרוסקופיות של צבע דיווח pH רגיש לעקוב וריאציות pH כתוצאה מהובלת מצע מונחה פרוטון. הבחירה של צבע פלואורסצנטי תמנע תופעות artifactual בשל האופי ההידרופובי של המצע.
קושי נוסף הוא הדור של שיפוע פרוטון. ניתן למצוא כמה פרוטוקולים בספרות. ביניהם, השימוש בטכניקת valinomycin הוא נפוץ אך שהראינו שזה מייגע לבצע 10-11. יתר על כן הואלא לשחזור וזה לא הפיך. אנחנו נקטו השימוש בbacteriorhodopsin (BR), משאבת פרוטון אור הופעל מsalinarium Halobacter, archaeon halophilic הימי גראם שלילי לחייב אירובי. חלבון זה coreconstituted ליפוזומים עם MexB ו, על תאורה, BR משאבות פרוטונים בתוך ליפוזומים ולכן יוצר ΔpH (חומצי בפנים) נדרש על ידי החלבון להעביר את המצע 12-13.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים הליך הכינון מחדש מיועד למנסה לאמוד תחבורת חלבון קרום. הוקם פעם, הליך הכינון מחדש החלבון מוביל למדידות, כי הם מאוד לשחזור. עם זאת, התנאים המדויקים עבור בנייה מחדש של החלבונים משתנים מחלבון אחד למשנו. טיפול הרבה חייב להילקח באופטימיזציה של הפרמטרים הבאים: א) איכות הטיהור (טוהר והעדר החומר מצטבר); ii) יעילות של צעד solubilizing חומר הניקוי (במידת האפשר, חומרי ניקוי CMC נמוכים צריכים להיות מועדף משום שהם קלים יותר לקבל להיפטר מ); iii) desorption של חומרי הניקוי (זה למשל ניתן לשלב את השימוש בחרוזי פוליסטירן בצעד דיאליזה אבל זה עלול להשפיע על שיעור desorption, פרמטר קריטי לפעילות הבאה של החלבון, ראה נ"צ [ 9]); ד) הכינון מחדש שומנים (האופי הכימי של השומנים בדם, השומנים בדם ליחס חלבון, הנוכחות של amphiph נוסףIles הם פרמטרים קריטיים שחייבים להיות מגוון ומותאם). בטמפרטורה בנוסף וזמן דגירה משפיע על כל הנושאים הללו.
בקרת איכות היא אפוא קדמונית בכל שלב של הליך הכינון מחדש. מנקודת מבט זו, פיזור אור הוא טכניקה מאוד נוחה כי זה מהיר, הורסות, וזה רק דורש 20 μl של מדגם בריכוז בטווח מייקרו. ברגע שproteoliposomes נוצרים, שיפוע סוכרוז גם הוא לעזר רב משום שהיא פותחת את הדרך לאימות שיטתית של הכינון מחדש: איכותי (הוא החלבון אכן משובץ לתוך קרום יפוזום), כמו גם כמותית (כמה חלבון ביפוזום אחד). זה האחרון יהיה לטפל על ידי בדיוק מדידת החלבון וריכוזי שומנים בדם.
assay שלנו אינו מסתמך על טיטרציה של המצע עצמו וזה נמנע משיקולים שלא בנוח בנוגע לדיפוזיה פסיבית artifactual האפשרי של המולקולה בשל מחיצות הידרופובי בקרום. Assay מנצל מאפיינים של pyranine כמו בדיקה אמינה וכמותי לשינויי pH הניטור. התוצאות שלנו הן בהסכם עם תוצאות שהושגו בהליך אחר שבו היווצרות שיפוע הפרוטון בוצעה באמצעות valinomycin 10, אבל זה מאפשר שיפוע חזק יותר ולשעתק 11. בנוסף, שיפוע הפרוטון יכול להיות מכוון בדיוק, פשוט על ידי שינוי הריכוז של החיץ (לפרטים נוספים ראה Verchere et al. 12).
בהליך מדידת שליטה מתבצעת ראשונה בהיעדרו של מצע (זה נותן גישה לפעילות הפסיבית של החלבון). פעילות טרנספורטר חלבון קרום בפועל לאחר מכן נמדדת לאחר המצע כבר הוסיף באותו קובט. זה באמת נכס, כי הניסוי יכול להיחשב כתוצאה אמיתית, שאינה דו משמעית, הנגרם מצע.
אף אוזן גרון "> הפרוטוקול יכול להיות מותאם לתפוקה גבוהה בינונית (למשל מדידות 96 בארות) אוטומציה כי מאיר את המדגם מעורר את התגובה. האוטומציה ועמות יהיו מורכבות בהכנת קבוצה גדולה של proteoliposome, ומחלק aliquots ב96 בארות צלחת. מצעים (וגם מעכבים אפשריים) אז היו ניתן להוסיף ולאחר הדגירה בחושך במשך 45 דקות הצלחת תהיה נתון למחזורי מדידת הקרינה התאורה / pyranine על קורא microplate.לקבלת מידע נוסף על הפרוטוקול, קוראים מוזמנים לקרוא Verchere et al. 12,13
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי Nationale de la משוכלל ונדיר סוכנות הידיעות (פרויקט ANR-2010-BLAN-1535) ועל ידי מענק מהאזור איל דה פרנס (DIM-Malinf 110058).
Materials
| DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850375C |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C8667 |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93427 |
| Valinomycin | Invitrogen | V-1644 |
| Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid) | Invitrogen | H-348 |
| DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside) | Affymetrix | D310LA |
| Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes) | Avanti Polar Lipids | 610000 |
| Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 |
| Econo-Pac Chromatography empty column | Biorad | 732-1010 |
| Desalting columns | Bio-Rad | 54805 |
| Dynamic light scattering instrument | Wyatt Technology | DynaPro NanoStar |
| Fluorometer JASCO FP-6200 | JASCO | 6816-J002A |
References
- Granseth, E., et al. Membrane protein structural biology – How far can the bugs take us? (Review). Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).
- Nikaido, H. Multidrug resistance in bacteria. Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).
- Pos, K. M. Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump. Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).
- Murakami, S., et al. Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism. Nature. 443 (7108), 173 (2006).
- Seeger, M. A. Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism. Science. 313 (5791), 1295 (2006).
- Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa. J Mol Biol. 389 (1), 134 (2009).
- Su, C. C., et al. Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli. Nature. 470 (7335), (2011).
- Nikaido, H., Takatsuka, Y. Mechanisms of RND multidrug efflux pumps. Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).
- Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in enzymology. 372, 65 (2003).
- Aires, J. R., Nikaido, H. Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli. J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).
- Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys. Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).
- Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press. , (2012).
- Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps. Sci Rep. 2, 306 (2012).
