In vitro Investigação do MexAB efluxo Bomba De Pseudomonas aeruginosa

1. Produção e purificação de proteínas Mexa, MexB de Pseudomonas aeruginosa Transforme os plasmídeos contendo os genes Mexa e MexB em um E. coli estirpe de produção (por exemplo, C43 DE3). Placa em LB Agar suplementado com o antibiótico apropriado. Escolha uma única colônia para inocular um pré-cultivo O / N. Na manhã seguinte, inocula a pré-cultura em 1 L de LB e crescer a 37 ° C, sob agitação (240 rpm). Uma vez que as células tenham atingido a fase exponencial (DO600 = 0,6-0,8) induzir com IPTG a 1 mM. Realizar a indução por 2-3 horas a 30 ° C, sob agitação. Células de centrifugação (9000 xg durante 20 minutos) e ressuspender em 30 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM. Disrupt células usando uma prensa francesa (10.000 psi, 4 pass). Descarte as células intactas e corpos de inclusão por centrifugação a 9000 xg por 20 min. Membranas de pellets 1 hora a 100.000 x g e resuspend cada pellet em 30 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM. Determinar a concentração de proteína total da membrana utilizando o ensaio colorimétrico de BCA e solubilizar as membranas de O / N com 2% de maltósido de dodecilo (DDM) em um volume final determinada de modo que o detergente: proteína é de 1:1,5 (w / w). Ultracentrífuga a 100.000 xg durante 1 h para descartar o material não solubilizado e agregados. Incubar o sobrenadante, durante 2 horas a 4 ° C com uma resina de níquel (mexa purificação) ou uma resina de cobalto (MexB purificação) equilibrada com bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol a 5% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. Despeje a resina em uma coluna vazia. Recolher o fluir. Lava-se a resina com 50 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM, em seguida, com 25 ml de bis-Tris 10 mM, pH 6, glicerol 5% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. Eluir o protein com 20 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol a 5% (w / v), imidazol 300 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. Concentra-se a proteína com um dispositivo de ultrafiltração até 3 ml e carga sobre uma coluna de dessalinização, equilibrada com um tampão livre de imidazol. Pouco antes de reconstituição (ver abaixo), ultracentrífuga proteínas solubilizadas (100.000 xg por 20 min) para se livrar de lipídios e proteínas não solubilizado. Em seguida, concentra-se a proteína novamente até 0,3 ml. Bacteriorodopsina de Halobacter Salinarium Cultivar células Salinarium Halobacter sob iluminação a 37 ° C durante 10 dias num meio de crescimento líquido contendo NaCl 4 M, MgSO4 a 150 mM, citrato 10 mM, KCl 30 mM, extracto de levedura 5 g / L, e peptona 5 g / L. Disrupt células por diálise contra água deionizada. Purifica-se a membrana de púrpura de 30-40% (w / v) gradiente de sacarose (100.000 xg durante 17 horas). Solubiliza-se a suspensão de membrana com 2% octylglucOside durante 24 horas a 37 ° C (volume para a solubilização, a fim de voltar a suspender a membrana a um detergente 2:1 (w / w): proteína). Estimar a concentração de BR solubilizado usando ε (570 nm) = 54.000 M-1 cm-1. Pouco antes de reconstituição (ver abaixo), ultracentrífuga a BR solubilizado (100.000 xg por 20 min) para se livrar de lipídios e proteínas não solubilizado. Nota: As membranas nativas são naturalmente enriquecida em BR por isso não purificação adicional é necessária. 2. Preparação de proteolipossomas A formação de lipossomas: Coloque 400 ul de DOPC dissolvido em clorofórmio (25 mg / ml) em um copo de vidro e adicionar 1,5 mg de colesterol armazenado como um pó. Seca-se-lhes imediatamente antes da manipulação sob uma corrente de azoto ou de vácuo durante pelo menos uma hora numa proveta de vidro. O DOPC: proporção molar de colesterol é de 3,3:1. Depois de terem secado, hidratar os lípidos com 1 ml de HEPES 25 mM, pH 7,K 2 SO 4 100 mM, MgCl2 2 mM, 2 mM de piranina. A suspensão deve aparecer turvação nesta fase. Aquece-se a solução durante 10 min a 37 ° C. Sonicar durante 10 min a 40 W com 30 seg de pulso, 30 sec ciclos de pausa à TA. A suspensão deve aparecer clara nesta fase. Para obter uma população de lipossomas monodispersas, realizar dois ciclos de extrusão e para cada ciclo, passar a suspensão de lipossomas através do filtro, pelo menos, 11x. Para o primeiro ciclo, utilizar uma membrana de tamanho de poro de 200 nm e para o segundo ciclo, utilizar uma membrana de tamanho de poro de 100 nm. Medições de dispersão de luz dinâmica pode ser realizada nesta etapa para verificar a homogeneidade da suspensão. Incorporação de proteínas Princípio: proteínas de membrana pode ser reconstituída em lipossomas, graças ao efeito solubilizante de detergentes. Lipossomas detergente solubilizou-se a incubação com a proteína de membrana solubilizada em detergente e a formação do proteoliposomes é desencadeada por uma rápida eliminação do detergente com grânulos de poliestireno 9. Adicionar 28 mg de Triton X-100 (0,56% final) e incubar O / N a 4 ° C (a temperatura de solubilização pode ser adaptado para a proteína a ser estudado). Adicionar a proteína solubilizada em detergente (BR, MexB e mexa) para os lipossomas dissolvidos, e incubar 15 min a 4 ° C. Adicionar as proteínas para a suspensão de lipossomas solubilizado nas seguintes proporções (w / w): lípidos / MexB = 20, MexB / mexa = 2,5, e lípidos / BR = 30. Adicionar pérolas de poliestireno em um 30:1 grânulos: proporção de detergente (w / w, considerando o peso total do detergente, inclusive detergente adicionado com as proteínas purificadas) e incubar 5 h, no escuro (por causa da BR) à TA sob suave agitação. Antes deste processo, activar as BioBeads com metanol e etanol e incubação extensivamente lava-se com água. Purifica-se a proteína proteolipossomos e substratos livres utilizando um PD-10coluna de dessalinização, equilibrada com HEPES 25 mM, pH 7, K 2 SO 4 100 mM e MgCl 2 a 2 mM. Armazenar os proteolipossomas a 18 ° C no escuro até 2-3 semanas. Avaliação da eficácia de reconstituição em gradiente de sacarose. Para verificar que tanto o MexB ea BR foram reconstituídos em lipossomos, purificar a suspensão proteolipossomos em um gradiente de sacarose descontínua. Suavemente resolver os proteolipossomas em um gradiente de cinco camadas de sacarose (60%, 20%, 10%, 5% e 2,5%, w / v). Ultracentrifuge para 17 horas a 100.000 xg (com aceleração mínima e taxas de desaceleração). Recolher cuidadosamente as várias fracções do gradiente (especialmente as interfaces entre cada camada de sacarose), e analisadas em SDS-PAGE (10%) por meio da coloração com Coomassie ou transferência de Western. Proteínas agregadas são encontrados no fundo do tubo, enquanto que, as proteínas de detergente solubilizado nonincorporated são encontrados na parte superior dao tubo. Proteolipossomos e lipossomas são encontrados nas interfaces de sacarose que correspondem à sua densidade intrínseca. Lipossomas vazios são recuperados mais acima no gradiente do que os proteolipossomos. 3. A medição de fluorescência Efectuar as medições de fluorescência a 25,0 ° C por meio de um espectrofluorómetro permitindo medições de duplo comprimento de onda (luz de Xe, 150 W). Períodos de iluminação alternativa (para ativar a BR com comprimentos de onda de excitação / emissão de 550 nm / 550 nm) e medições de fluorescência com comprimentos de onda de excitação / emissão de 455 nm / 509 nm por 2 segundos para medir a fluorescência piranina. Defina as larguras de banda de excitação e emissão de 5 nm. Efectuar as medições na presença de 50 nM de valinomicina para prevenir a formação de um potencial de membrana ΔΨ inversa. Nota: Na verdade, porque as bombas de prótons BR, há mais cargas positivas no interior do lipossoma do que fora. Esta cargagradiente podem ser descartados utilizando valinomicina, que é um K + ionóforo selectiva. Uma vez adicionados à valinomicina lipossomas suspensão, tal como uma molécula hidrófoba, se inserir na membrana do lipossoma, transportar passivamente K +, e, portanto, a dissipar o potencial de membrana ΔΨ.