Pseudomonas aeruginosa itibaren MexAB dışa atım pompa in vitro olarak incelenmesi

1.. Protein Üretimi ve Saflaştırılması Mexa, Pseudomonas aeruginosa'dan MexB , Bir E. Mexa ve MexB genleri barındıran plasmidleri Transform coli üretim suşu (örneğin C43 DE3). LB agar levhalar ortam, uygun antibiyotik ile takviye edilmiştir. O / N Önlüktür aşılamak için tek bir koloni seçin. Ertesi sabah, LB 1 L ön kültür aşılamak ve çalkalanarak (240 rpm) 37 ° C'de büyür. Hücreler üstel faz ulaştığında (OD 600 = 0.6-0.8) 1 mM IPTG ile neden. Ajitasyon altında 30 ° C'de 2-3 saat boyunca indüksiyon yapın. Santrifüj hücreleri (20 dakika boyunca 9,000 x g) ve 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCI 150 mM olarak tekrar süspansiyon. Bir Fransız basını (10,000 psi, 4 geçişi) kullanarak hücreleri bozar. 20 dakika boyunca 9,000 x g de santrifüj ile bozulmamış hücreler ve cisimciği atın. 100.000 xg ve r Pelet membranlar 1 saat30 ml Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 20 gliserol (a / h), 10 mM imidazol, 500 mM NaCl, her pelet esuspend. BCA kolorimetrik deneyi kullanılarak toplam membran protein konsantrasyonu belirlenir ve bu, deterjan şekilde belirlenen bir son hacim içinde% 2 dodesil maltoside (DDM) ile zarları O / N çözündürülmesi: protein (a / a) 1:1.5. Non çözündürülmüş ve toplanmış malzemenin atmak için 1 saat boyunca 100,000 x g'de Ultrasantrifüj. Bir nikel reçinesi (Mexa saflaştırma) ya da Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 5 gliserol ile dengelenmiş bir kobalt reçinesi (MexB saflaştırma) ile 4 ° C'de 2 saat boyunca inkübe supernatant (ağ / h), 10 mM imidazol, NaCl 500 mM, DDM% 0.2. Boş bir sütunun içindeki reçineyi dökün. Sayesinde Akışı toplayın. Daha sonra Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 20 gliserol (a / h), 10 mM imidazol, 500 mM NaCl,% 0.2 DDM, Bis-Tris 10 mM, pH 6, gliserol, 25 ml ile 50 ml reçine yıkayın % 5 (ağ / h), 10 mM imidazol, 500 mM NaCl,% 0.2 DDM. P Zehir20 mi Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 5 gliserol (ağ / h), 300 mM imidazol, 500 mM NaCl,% 0.2 ile DDM K'e. Bir imidazol içermeyen tampon maddesi ile dengelenmiş bir tuz giderme kolonu üzerinde 3 ml ve yüke göre aşağı bir ultrafiltrasyon cihazı ile protein konsantre edilir. Sadece daha önce sulandırma (aşağıya bakınız), çözünür proteinler lipid ve çözülmeyen proteinlerin kurtulmak için (20 dakika boyunca 100,000 xg) Ultrasantrifüj. Daha sonra 0.3 ml yeniden protein konsantre edin. Halobacter salinarium dan bacteriorhodopsin 4 M NaCl, MgSO 4 150 mM, 10 mM sitrat, 30 mM KCl, maya özütü 5 g / L, pepton ve 5 g / L ihtiva eden bir likit büyüme ortamı içinde 10 gün boyunca 37 ° C'de aydınlatma altında Halobacter salinarium hücrelerin büyümesine Iyonu giderilmiş suya karşı diyaliz hücreleri bozabilir. Bir% 30-40 üzerinde mor membran (ağ / hac) sakroz gradyanı (17 saat boyunca 100,000 x g) saflaştırılır. % 2 octylgluc ile zar süspansiyonu çözünürleştirilir37 ° C (: protein oranı, 2:01 (a / a) deterjan de membran tekrar süspansiyon için çözündürme için hacim) 24 saat boyunca oside. Ε (570 nm) = 54000 M-1cm-1 ile çözündürülmüş BR konsantrasyonunu tahmin. Sadece daha önce sulandırma (aşağıya bakınız), lipidler ve çözülmeyen proteinlerin kurtulmak için çözündürülmüş BR (20 dakika boyunca 100,000 xg) Ultrasantrifüj. Not: yerel Zarlar doğal çok daha fazla saflaştırma gerekli br zenginleştirilmiştir. 2. Proteoliposomes hazırlanması Lipozom sistemi: bir cam beher içinde kloroform ile (25 mg / ml) içinde çözülmüş DOPC 400 ul koyun ve bir toz olarak saklanır kolesterol 1,5 mg ekleyin. Bir cam kap içinde, en az 1 saat boyunca azot ya da sadece bir vakum buhar altında manipülasyon önce onları kurutun. DOPC: kolesterol mol oranının 3.3:1 olduğunu. Bu kuruduktan sonra, 25 mM HEPES pH 7, 1 ml ile lipitleri hidratK 2 SO 4 100 mM, 2 mM MgCl2, 2 mM pyranine. Süspansiyon bu aşamada bulanık görünmelidir. 37 ° C'de 10 dakika için çözüm ısıtın 30 saniye darbe, oda sıcaklığında 30 saniye aralık döngüsü ile 40 W da 10 dakika için sonikasyon. Süspansiyon bu aşamada net görünmelidir. Lipozomların bir tek dağılımlı popülasyonu elde etmek için, ekstrüzyon, iki döngü yapabilir ve her bir döngü için, en az 11x filtreden lipozom süspansiyonu geçmektedir. İlk çevrim için, 200 nm'lik bir zar gözenek boyutuna kullanımı ve ikinci çevrim için, 100 nm'lik bir zar gözenek boyutu kullanın. Dinamik ışık saçılım ölçümleri, süspansiyonun homojenliğini kontrol etmek için bu aşamada gerçekleştirilebilir. Protein şirketleşme İlke: zar proteinleri deterjanların çözündürücü etkisi sayesinde Lipozomlar içinde yeniden edilebilir. Deterjan-çözünebilir lipozomlar p-çözünür deterjan zar proteini ve oluşumu ile kuluçkalanırroteoliposomes polistiren boncuklar 9 deterjan hızla ortadan kaldırılması ile tetiklenir. Triton X-100 (son% 0.56) içinde 28 mg eklenir ve 4 ° C (çözünürleştirme sıcaklık, protein çalışılmaktadır adapte edilebilir) de O / N inkübe edin. Çözündürülmüş lipozomlara deterjan-çözünür protein (BR, MexB ve Mexa) ilave edin ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe Lipidler / MexB = 20, MexB / Mexa = 2.5 ve lipidler / BR = 30: Aşağıdaki oranlarda (ağırlık / ağırlık) seviyesinde çözündürülmüş lipozom süspansiyonuna proteinleri ekleyin. (Saflaştırılmış protein ile eklenmiştir deterjan içeren deterjan toplam ağırlığı göz önüne alındığında w / w,) deterjan oranı ve yumuşak altında oda sıcaklığında (nedeniyle BR) karanlıkta 5 saat, inkübe edilir: a 30:1 boncuk polistiren boncuk ekleyin karıştırıldıktan. Bundan önce prosedüre, metanol ve etanol inkübasyon ile Biobeads etkinleştirmek ve yaygın olarak, su ile yıkayın. , Bir PD-10 kullanılarak proteoliposomes protein ve serbest alt tabakaları arındırınHEPES, 25 mM pH 7, K 2 ile dengelenmiş tuz alıcı sütun SO 4 100 mM ve 2 mM MgCI2. Kadar 2-3 hafta boyunca karanlıkta 18 ° C 'de proteoliposomes saklayın. Sükroz gradyanı üzerinde yeniden oluşturma etkinliğinin değerlendirilmesi. MexB ve BR hem lipozomlarda yeniden olup olmadığını kontrol etmek için, bir süreksiz sukroz gradient proteoliposome süspansiyon arındırmak. Yavaşça sakaroz beş tabakalı bir gradyanı üzerinde proteoliposomes yerleşmek (% 60,% 20,% 10,% 5 ve% 2.5 ağ / h). (Minimal hızlanma ve yavaşlama oranları ile) 100,000 xg'de 17 saat Ultrasantrifüj. Dikkatlice çeşitli gradyan fraksiyonları (sükroz her katman arasında özellikle arayüzler) toplamak ve Coomassie boyama ya da Batı lekeleme ile SDS-PAGE (% 10) üzerinde analiz. Katılmayan, deterjan-çözünür proteinler en üstünde bulunan ise kümelenen proteinlerin, tüpün alt kısmında bulunantüpü. Proteoliposomes ve lipozomlar, kendi iç yoğunluğuna karşılık gelen sükroz arabirimleri bulunur. Boş lipozomlar proteoliposomes daha Degradede öteye kurtarıldı. 3. Floresan ölçümü Dual dalga boyu ölçümleri için izin veren bir spektrofotometreyi (Xe lambası, 150 W) ile 25.0 ° C 'de flüoresan ölçümlerini gerçekleştirir. Alternatif aydınlatma dönemleri (550 Nm / 550 nm uyarma / emisyon dalga boyları ile BR etkinleştirmek için) ve pyranine floresan ölçmek için 2 saniye boyunca 455 nm / 509 nm uyarma / emisyon dalga boylarında floresans ölçümleri. 5 nm uyarma ve emisyon bant genişlikleri ayarlayın. Bir ters zar potansiyeli ΔΨ oluşumunu önlemek için 50 nM valinomycin mevcudiyetinde ölçümleri yapın. Not: Aslında, BR proton pompalar, çünkü dışarıda daha lipozom içinde daha olumlu ücretleri vardır. Bu ücretgradyan bir K + iyonofor seçici olan, valinomycin ile iptal edilebilir. Bir kez lipozomlar, süspansiyon valinomycin ilave bir hidrofobik molekül olarak, lipozom zarı içine yerleştirin pasif olarak K + taşıma ve bu nedenle, membran potansiyeli ΔΨ buharlaşır.