В пробирке исследование MexAB отток насос с синегнойной палочки

1. Белок Получение и очистка MEXA, MexB от синегнойной палочки Transform плазмиды, несущие гены MEXA и MexB в Е. палочка производство Штамм (например C43 DE3). Пластина на LB агаре среде, дополненной соответствующим антибиотиком. Выберите одну колонию для инокуляции в O / N прекультуры. На следующее утро инокуляции предварительной культуры в 1 л LB и расти при 37 ° С при перемешивании (240 оборотов в минуту). Как только клетки достигали экспоненциальной фазы (OD 600 = 0,6-0,8) индуцируют с помощью 1 мМ IPTG. Выполнение индукции в течение 2-3 ч при 30 ° С при перемешивании. Центрифуга клетки (9000 х г в течение 20 мин) и ресуспендируют в 30 мл Трис-HCl 20 мМ, рН 8, 150 мМ NaCl. Разрушить клетки с использованием французской прессе (10000 фунтов на квадратный дюйм, 4 чел). Откажитесь неразрушенных клеток и телец включения путем центрифугирования при 9000 мкг в течение 20 мин. Пелле мембраны 1 час при 100000 х г и гesuspend каждый шарик в 30 мл Bis-Tris 10 мМ, рН 7,4, глицерин 20% (вес / объем), 10 мМ имидазола, NaCl 500 мМ. Определить общую концентрацию мембранного белка с использованием BCA колориметрического анализа и солюбилизации мембран O / N 2% додецилмальтозид (DDM) в конечном объеме, определяемом так что моющее средство: белок 1:1,5 (вес / вес). Ультрацентрифуга при 100000 мкг в течение 1 часа, чтобы отбросить без солюбилизированный и агрегированный материал. Инкубировать супернатант в течение 2 часов при 4 ° С с никелевым смолы (очистки MEXA) или кобальта (смолы очистки MexB), уравновешенную Bis-Tris 10 мМ, рН 7,4, 5% глицерин (вес / объем), 10 мМ имидазол, NaCl 500 мМ, DDM 0,2%. Налейте смолы в пустой колонки. Соберите течь через. Промыть смолу с 50 мл Bis-Tris 10 мМ, рН 7,4, глицерин 20% (вес / объем), 10 мМ имидазола, NaCl 500 мМ, DDM 0.2%, затем 25 мл Bis-Tris 10 мМ рН 6, глицерин 5% (вес / объем), имидазол 10 мМ, NaCl 500 мМ, DDM 0,2%. Элюции рrotein с 20 мл Bis-Tris 10 мМ, рН 7,4, глицерин 5% (масса / объем), имидазола 300 мМ, NaCl 500 мм, DDM 0,2%. Концентрат белка с ультрафильтрационной устройства до 3 мл и нагрузки на обессоливающей колонке, уравновешенной имидазола свободного буфера. Непосредственно перед восстановлением (см. ниже), Ультрацентрифуга солюбилизированного белка (100000 х г в течение 20 мин), чтобы избавиться от липидов и нерастворимого белка. Тогда сосредоточиться белок снова до 0,3 мл. Бактериородопсин от Halobacter salinarium Grow Halobacter salinarium клеток при освещении при 37 ° С в течение 10 дней в жидкой среде для роста, содержащей NaCl 4 м, MgSO 4 150 мм, цитрат 10 мм, 30 мм KCl, дрожжевой экстракт 5 г / л пептона и 5 г / л Прерывание клетки путем диализа против деионизированной воды. Очищают фиолетовый мембраны на 30-40% (вес / объем) в градиенте сахарозы (100000 мкг в течение 17 ч). Растворения суспензии мембран с 2% octylglucoside в течение 24 ч при 37 ° С (объем для солюбилизации для того, чтобы ресуспендируют мембрану в 2:01 (вес / вес) моющего средства: соотношение белка). Оцените концентрацию растворенного БР с использованием ε (570 нм) = 54000 М -1 см -1. Незадолго до восстановления (см. ниже), Ультрацентрифуга солюбилизированный BR (100000 мкг в течение 20 мин), чтобы избавиться от липидов и нерастворимого белка. Примечание: нативные мембраны естественно, обогащенный BR таким образом дальнейшую очистку не требуется. 2. Подготовка Протеолипосомы Формирование липосом: Поместите 400 мкл DOPC растворяли в хлороформе (25 мг / мл) в стекл нный стакан и добавить 1,5 мг холестерина, хранящейся в виде порошка. Сушат их непосредственно перед манипуляций при потоке азота или в вакууме в течение не менее 1 часа в стеклянном стакане. ДОФХ: молярное соотношение холестерин 3,3:1. После того как они высохли, гидрат липиды с 1 мл 25 мМ HEPES рН 7,K 2 SO 4 100 мМ, MgCl 2 2 мМ, pyranine 2 мм. Подвеска должна появиться мутная на данном этапе. Раствор нагревают в течение 10 мин при 37 ° С Разрушать ультразвуком в течение 10 мин при 40 Вт с 30 сек импульса, 30 сек циклов пауза при комнатной температуре. Подвеска должна появиться ясно на данном этапе. Для получения монодисперсное население липосом, выполните два цикла экструзии и для каждого цикла, пройти суспензию липосом через фильтр, по крайней мере 11x. Для первого цикла, использовать мембраны размером пор 200 нм, а для второго цикла, использовать мембраны размером пор 100 нм. Измерения динамического рассеяния света может быть выполнена на этом этапе, чтобы проверить однородность суспензии. Белок включение Принцип: мембранные белки могут быть восстановлены в липосомы, благодаря солюбилизирующего эффект моющих средств. Моющее средство солюбилизированную липосомы инкубируют с детергентом солюбилизированного белка мембраны и формирование рroteoliposomes инициируется быстрой ликвидации моющего средства с полистирольных шариков 9. Добавить 28 мг Triton X-100 (0,56% конечная) и инкубировать O / N при 4 ° С (температура солюбилизации могут быть адаптированы к белок изучается). Добавьте моющее средство-солюбилизированного белка (BR, MexB и MEXA) в солюбилизированных липосом и инкубировать 15 мин при 4 ° С. Добавить белки в солюбилизированного суспензии липосом в следующих соотношениях (W / W): липиды / MexB = 20, MexB / MEXA = 2,5 и липидов / BR = 30. Добавить полистирольные шарики на 30:1 бисера: соотношение моющего средства (W / W, учитывая общий вес моющего средства, в том числе моющего средства с добавлением очищенных белков) и инкубировать 5 ч, в темноте (из-за БР) при комнатной температуре в нежный помешивая. До этой процедуры активации biobeads метанолом и этанолом инкубации и широко промывают водой. Очищают белок Протеолипосомы и бесплатные подложек с использованием PD-10колонка обессоливания уравновешенную HEPES 25 мМ рН 7, K 2 SO 4 100 мм и MgCl 2 2 мм. Храните Протеолипосомы при 18 ° С в темноте в течение до 2-3 недель. Оценка эффективности восстанавливающей на градиенте сахарозы. Чтобы проверить, что и MexB и БР были воссоздана в липосомы, очистить proteoliposome подвеску на разрывной градиент сахарозы. Осторожно урегулировать Протеолипосомы на пять слоя градиента сахарозы (60%, 20%, 10%, 5% и 2,5%, вес / объем). Ультрацентрифуга течение 17 ч при 100 000 мкг (с минимальным ускорением и скорости замедления). Осторожно собрать различные градиентные фракции (особенно интерфейсы между каждым слоем сахарозы) и анализировать их на SDS-PAGE (10%), использу Кумасси окрашивания или Вестерн-блоттинга. Агрегированные белки находятся в нижней части трубки, в то время как nonincorporated, моющие-солюбилизированного белка находятся в верхней частитрубка. Протеолипосомы и липосомы находятся на сахарозы интерфейсов, которые соответствуют их внутренней плотности. Пустые липосомы восстанавливаются дальше вверх по градиенту, чем протеолипосом. 3. Флуоресценции Измерение Провести измерения флуоресценции при 25,0 ° С с использованием спектрофлуориметре, позволяющий для измерения двойного длина волны (Xe лампы, 150 Вт). Альтернативные периоды освещения (для активации BR с длинами волн возбуждения / эмиссии 550 нм / 550 нм) и измерения флуоресценции с длиной волны возбуждения / эмиссии 455 нм / 509 нм в течение 2 сек для измерения флуоресценции pyranine. Установите возбуждения и эмиссии полосы пропускания до 5 нм. Выполните измерения в присутствии 50 нМ валиномицина чтобы предотвратить образование обратного мембранного потенциала ΔΨ. Примечание: В самом деле, потому что BR насосы протоны, есть более положительные заряды внутри липосомы, чем снаружи. Этот зарядградиент может быть отброшен с помощью валиномицин, который представляет собой K + селективный ионофор. После добавления к липосомы подвески валиномицина, как гидрофобной молекулой, будет вставить в липосомной мембране, пассивно транспортировки K + и, следовательно, рассеивать мембранного потенциала ΔΨ.