緑膿菌からの MexAB排出ポンプの体外調査に

1。タンパク質生産および精製 MEXA、 緑膿菌からMexB EにMEXAとMexB遺伝子を保有するプラスミドを変換大腸菌産生株（ 例えば C43 DE3）。 LB寒天上で平板培地適切な抗生物質を補充した。そのO / N前培養に接種するために、単一のコロニーを採取。翌朝、LB 1Lに前培養に接種し、攪拌（240回転）の下で37℃で成長する。 細胞が対数期に達したら（OD 600 = 0.6〜0.8）が1 mMのIPTGで誘導する。撹拌下に30℃で2〜3時間の誘導を行う。 遠心分離機細胞（20分間9000×g）で、および30ミリリットルのトリス-HCl 20 mMの、pHが8、NaClを150 mMの中で再懸濁します。 フレンチプレス（10,000 psiで、4パス）を使用して、細胞を破砕。 20分間9000×gで遠心分離することにより、破壊されていない細胞と封入体を捨てる。 を100,000×gとrのペレット膜を1時間30ミリリットルのBis-Tris、10mMのpH7.4の、グリセロール20％（w / v）の、10mMのイミダゾール、500mMのNaClを各ペレットをesuspend。 BCA比色アッセイを用いて総膜タンパク質濃度を決定し、そのように決定洗剤が最終容積の2％ドデシルマルトシド（DDM）を有する膜O / Nを可溶化：タンパク質は、（w / w）で1:1.5である。 非可溶化および凝集物質を廃棄する1時間、100,000×gで超遠心機。 ニッケル樹脂（MEXA精製）又はビス – トリス、10mMのpH7.4の、グリセロール5％で平衡化したコバルト樹脂（MexB精製）を用いて4℃で2時間、上清をインキュベート（w / v）と、イミダゾールが10mM、NaClが500 mMの、DDM 0.2％。 空の列に樹脂を注ぐ。通る流れを収集します。 次いで、ビス – トリス、10mMのpH6の25mlで、グリセロールを20％（w / v）と、イミダゾールが10mM、NaClが500 mMの、DDM、0.2％のBis-Tris、10mMのpH7.4の50mlで樹脂を洗浄し、グリセロール5％（w / v）の、10mMのイミダゾール、500mMのNaClを、0.2％DDM。 Pを溶出5％グリセロール、300mMのイミダゾール、500mMのNaClを、DDM、0.2％（w / vの）を20mlのBis-Tris、10mMのpH7.4のでrotein。 イミダゾールを含まない緩衝液で平衡化した脱塩カラム上の3ミリリットルと負荷まで限外濾過装置でタンパク質を濃縮。ただ再構成する前に（下記参照）、可溶化したタンパク質、脂質および非可溶化タンパク質を取り除くために（20分を100,000×g）を超遠心。その後、0.3ミリリットル再びタンパク質を濃縮。 Halobacterサリナリウムからバクテリオロドプシン NaClの4M、MgSO 4で 150 mMのクエン酸塩を10mM、KClを30mMの、酵母エキス5gの/のL、ペプトンを5g / Lを含有する液体増殖培地中で10日間、37℃、照明下Halobacterハロバクテリウム属の細胞を増殖させる脱イオン水に対して透析することによって細胞を破壊。 百分の30から40に紫膜（w / v）のショ糖勾配（17時間を100,000×g）を精製する。 2％の膜懸濁液を可溶化octylgluc37℃（：タンパク質比2:1（w / w）の洗剤で膜を再懸濁するために、可溶化のためのボリューム）で24時間オシド。 ε（570ナノメートル）= 54,000 M -1 cm -1のを使用して可溶化、BRの濃度を推定。ただ再構成する前に（下記参照）、脂質および非可溶化タンパク質を取り除くために、可溶化し、BR（20分を100,000×g）を超遠心。 注：さらなる精製が必要とされないので、本来の膜は、自然に、BRに富んでいる。 2。プロテオリポソー​​ムの調製リポソーム形成：ガラスビーカーにクロロホルムに溶解DOPCの400μL（25 mg / mlの）を入れて、粉末として格納されているコレステロール1.5ミリグラムを追加します。ガラスビーカー内の少なくとも1時間だけ窒素や真空の蒸気の下で操作する前にそれらを乾燥させます。 DOPC：コレステロールのモル比は3.3:1である。 彼らは乾燥した後に、HEPES 25 mMのpHを7 1mlで脂質を水和、K 2 SO 4の100mM、MgCl 2を 2 mMの、ピラニン2mmである。サスペンションは、この段階で濁っ表示されます。 37℃で10分間この溶液を加熱30秒パルスに40 W、RTで30秒休止サイクルで10分間超音波処理する。サスペンションは、この段階で明確に表示されます。 リポソームの単分散集団を得るためには、押出成形の2つのサイクルを実行し、各サイクルのために、少なくとも11Xのフィルターを通してリポソーム懸濁液を渡します。最初のサイクルのために、200nmの膜の孔サイズを使用し、第二サイクルのために、100nmの膜の孔サイズを使用する。動的光散乱測定は、懸濁液の均質性を確認するために、このステップで行うことができる。 タンパク質混入原理：膜タンパク質はリポソーム中に界面活性剤の可溶化効果のおかげで再構成することができる。界面活性剤で可溶化リポソームは、Pの界面活性剤で可溶化膜タンパク質及び形成をインキュベートするroteoliposomesはポリスチレンビーズ9の洗剤の迅速な排除によってトリガされます。 トリトンX-100（最終0.56％）28mgのを追加し、4°C（可溶化温度はタンパク質が研究さに適合させることができる）でO / Nインキュベートする。 可溶化したリポソームに界面活性剤で可溶化タンパク質（BR、MexBとMEXA）を追加し、4℃で15分間インキュベート脂質/ MexB = 20、MexB / MEXA = 2.5、および脂質/ BR = 30：次の比（W / W）で可溶化リポソーム懸濁液にタンパク質を追加します。 穏やか下、室温で（理由のBr）（精製タンパク質を添加した洗剤など、洗剤の総重量を考慮し、W / W）、洗剤比と5時間インキュベートする、暗闇の中で：30:1ビーズでポリスチレンビーズを追加攪拌する。この手順に先立ち、メタノール、エタノール、インキュベーションとバイオビーズを活性化させ、広範囲に水で洗い流してください。 PD-10を使用したプロテオタンパク質と無料の基質を浄化HEPES 25mMのpHが7、K 2 SO 4を 100 mMおよびMgCl 2を 2 mMので平衡化した脱塩カラム。 最長2〜3週間、暗所で18℃でプロテオリポソー​​ムを保存する。 ショ糖勾配上で再構成有効性の評価。 MexBとBRの両方が、リポソーム中に再構成されていることを確認するには、不連続ショ糖勾配上のプロテオリポソー​​ム懸濁物を浄化する。 穏やかにスクロースの五層勾配プロテオリポソー​​ムを決済（60％、20％、10％、5％、2.5％、w / v）である。 （最小限の加減速レートで）を100,000×gで17時間超遠心機。 慎重に様々勾配画分（ショ糖の各層の間に、特にインターフェイス）を収集し、クマシー染色やウエスタンブロット法を用いてSDS-PAGE（10％）上でそれらを分析。 nonincorporated、界面活性剤で可溶化タンパク質はの先頭に記述されている間に凝集したタンパク質は、チューブの底で発見されたチューブ。プロテオおよびリポソームは、その本質的な密度に対応してショ糖界面で発見された。空のリポソームは、プロテオよりも勾配で遠くまで回復している。 3。蛍光測定二重波長測定を可能にする分光蛍光計（Xeランプ、150 W）を使用して25.0℃で蛍光測定を行う。代替の照明期間（550Å/ 550 nmの励起/発光波長を有するBRをアクティブにする）と、ピラニン蛍光を測定するための2秒間は455nm / 509 nmの励起/発光波長を有する蛍光測定。 5 nmの励起および発光帯域幅を設定します。逆膜電位ΔΨの形成を防止するために、50 nMのバリノマイシンの存在下で測定を実施。 注：確かに、BRは、プロトンポンプので、外側よりもリポソームの内部より多くの正電荷が存在する。この電荷勾配は、K +選択性イオノフォアである、バリノマイシン使用して廃棄することができる。一度リポソームサスペンションバリノマイシンに追加、疎水性分子として、受動的にK +を輸送するため、膜電位ΔΨを放散、リポソーム膜に挿入されます。