In vitro enquête de la pompe à efflux MexAB De Pseudomonas aeruginosa

Une. Production et purification de protéines MexA, MexB de Pseudomonas aeruginosa Transformer les plasmides hébergeant les gènes MexA et MexB dans un E. souche de production coli (par exemple C43 DE3). Plaque sur gélose LB supplémenté avec l'antibiotique approprié. Choisissez une seule colonie pour inoculer une préculture O / N. Le lendemain matin, ensemencer la préculture dans 1 L de LB et de croître à 37 ° C sous agitation (240 rpm). Une fois que les cellules ont atteint la phase exponentielle (DO600 = 0,6 à 0,8) induisent avec 1 mM d'IPTG. Effectuer induction pour 2-3 heures à 30 ° C sous agitation. Centrifuger les cellules (9000 xg pendant 20 min) et les remettre en suspension dans 30 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM. Broyer les cellules en utilisant une presse française (10 000 psi, 4 passes). Jeter les cellules intactes et des corps d'inclusion par centrifugation à 9000 g pendant 20 min. Membranes Pellet 1 heure à 100 000 xg et resuspend chaque culot dans 30 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycérol 20% (p / v), de l'imidazole 10 mM, NaCl 500 mM. Déterminer la concentration totale en protéine de membrane en utilisant le dosage colorimétrique BCA et de solubiliser les membranes O / N avec 2% de maltoside de dodécyle (DDM) dans un volume final déterminé de telle sorte que le détergent: protéine est de 1:1,5 (p / p). Ultracentrifugation à 100 000 g pendant 1 h à jeter matériau non solubilisé et agrégées. Incuber le surnageant pendant 2 heures à 4 ° C avec une résine de nickel (de purification MexA) ou une résine de cobalt (de purification MexB) équilibrée avec du Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol à 5% (p / v), de l'imidazole 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM. Verser la résine dans une colonne vide. Recueillir le accréditives. Laver la résine avec 50 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycérol 20% (p / v), de l'imidazole 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM, puis avec 25 ml de bis-Tris 10 mM pH 6, le glycérol 5% (p / v), de l'imidazole 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM. Éluer le protein avec 20 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol à 5% (p / v), de l'imidazole 300 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM. Concentrer la protéine avec un dispositif d'ultrafiltration vers le bas à 3 ml et de la charge sur une colonne de dessalage équilibrée avec un tampon imidazole-libre. Juste avant la reconstitution (voir ci-dessous), ultracentrifugation les protéines solubilisées (100 000 xg pendant 20 minutes) pour se débarrasser des lipides et des protéines non solubilisées. Puis se concentrer de nouveau sur la protéine à 0,3 ml. Bactériorhodopsine de Halobacter salinarium Cultiver des cellules Salinarium Halobacter sous éclairage à 37 ° C pendant 10 jours dans un milieu de croissance liquide contenant du NaCl 4 M, MgSO 4, 150 mM, citrate 10 mM, KCl 30 mM, extraits de levure 5 g / L, et la peptone 5 g / L. Broyer les cellules par dialyse contre de l'eau déminéralisée. Purifier la membrane pourpre sur un 30 à 40% (p / v) de gradient de saccharose (100 000 xg pendant 17 h). Solubiliser la suspension membranaire avec 2% octylglucosidique pendant 24 heures à 37 ° C (volume de solubilisation afin de remettre en suspension la membrane à une 2:1 (poids / poids) du détergent: rapport de protéine). Estimer la concentration de BR solubilisé en utilisant ε (570 nm) = 54 000 M -1 cm -1. Juste avant la reconstitution (voir ci-dessous), l'ultracentrifugation BR solubilisé (100.000 g pendant 20 min) pour se débarrasser des lipides et des protéines non solubilisées. Remarque: Les membranes natives sont naturellement enrichis en BR donc pas de purification supplémentaire est nécessaire. 2. Préparation des protéoliposomes la formation de liposomes: Mettre 400 ul de DOPC dissous dans du chloroforme (25 mg / ml) dans un bêcher en verre et ajoute 1,5 mg de cholestérol stocké sous forme de poudre. Séchez-les juste avant manipulation sous un courant d'azote ou sous vide pendant au moins 1 heure dans un récipient en verre. La DOPC: rapport molaire de cholestérol est de 3,3:1. Après avoir séché, hydrater les lipides avec 1 ml de tampon HEPES 25 mM pH 7,K 2 SO 4 à 100 mM, MgCl 2 2 mM, 2 mM de pyranine. La suspension doit apparaître trouble à ce stade. Chauffer la solution pendant 10 min à 37 ° C. Ultrasons pendant 10 min à 40 W avec 30 impulsions sec, 30 sec pause cycles à la température ambiante. La suspension doit être clair à ce stade. Pour obtenir une population monodisperse de liposomes, effectuer deux cycles de l'extrusion et pour chaque cycle, passer la suspension de liposomes à travers le filtre au moins 11x. Pour le premier cycle, en utilisant une taille de pores de membrane de 200 nm, et pour le deuxième cycle, en utilisant une taille de pores de membrane de 100 nm. Mesures dynamiques de diffusion de la lumière peuvent être effectués à cette étape pour vérifier l'homogénéité de la suspension. Protéine incorporation Principe: membrane protéines peuvent être reconstitués dans des liposomes grâce à l'effet de solubilisation des détergents. Liposomes détergent solubilisées sont incubés avec la protéine membranaire solubilisée détergent et la formation de la proteoliposomes est déclenchée par une élimination rapide du détergent avec des billes de polystyrène 9. Ajouter 28 mg de Triton X-100 (0,56% final) et incuber O / N à 4 ° C (la température de solubilisation peut être adapté à la protéine à l'étude). Ajouter la protéine solubilisée par du détergent (BR, MexB et MexA) aux liposomes solubilisés et incuber 15 min à 4 ° C. Ajouter les protéines de la suspension de liposomes solubilisé dans les rapports suivants (p / p): lipides / MexB = 20, MexB / MexA = 2,5, lipides et / BR = 30. Ajouter des perles de polystyrène à une 30:1 perles: rapport de détergent (en poids / poids, compte tenu du poids total du détergent, y compris un détergent ajoutée avec les protéines purifiées) et incuber 5 heures, à l'obscurité (en raison de la BR) à température ambiante sous douce agitation. Avant cette procédure, activer les BioBeads avec du méthanol et de l'éthanol incubation et abondamment avec de l'eau de lavage. Purifier la protéine de protéoliposomes et substrats libres, utilisez un PD-10colonne de dessalage équilibrée avec de l'HEPES 25 mM pH 7, K 2 SO 4 et 100 mM de MgCl 2 2 mM. Conserver les protéoliposomes à 18 ° C dans l'obscurité jusqu'à 2-3 semaines. Évaluation de l'efficacité de reconstitution sur gradient de saccharose. Pour vérifier que les deux MexB et le BR ont été reconstitués dans des liposomes, de purifier la suspension de protéoliposome sur un gradient de saccharose discontinu. Régler délicatement les protéoliposomes sur un gradient de cinq couches de saccharose (60%, 20%, 10%, 5% et 2,5%, p / v). Ultracentrifugation pendant 17 heures à 100 000 xg (avec une accélération minimal et le taux de décélération). Recueillir soigneusement les diverses fractions de gradient (en particulier les interfaces entre chaque couche de saccharose) et de les analyser sur SDS-PAGE (10%) à l'aide Coomassie ou Western Blot. Protéines agrégées se trouvent au fond du tube, tandis que les protéines non incorporés, détergents solubilisé se trouvent en haut dele tube. Protéoliposomes et des liposomes se trouvent au niveau des interfaces de saccharose qui correspondent à leur densité intrinsèque. Liposomes vides sont récupérés plus loin dans la pente que les protéoliposomes. 3. Fluorescence Mesure Effectuer des mesures de fluorescence à 25,0 ° C en utilisant un spectrofluorimètre pour permettre des mesures deux longueurs d'onde (lampe Xe, 150 W). Périodes d'éclairage de substitution (pour activer BR avec longueurs d'onde d'excitation / émission de 550 nm / 550 nm) et des mesures de fluorescence de longueurs d'onde d'excitation / émission de 455 nm / 509 nm pendant 2 secondes pour mesurer la fluorescence pyranine. Définissez les excitation et d'émission des largeurs de bande de 5 nm. Effectuer les mesures en présence de 50 nM de valinomycine pour empêcher la formation d'une membrane ΔΨ potentiel inverse. Remarque: En effet, parce que les pompes à protons BR, il ya des frais plus positifs à l'intérieur du liposome qu'à l'extérieur. Cette chargegradient peut être éliminé en utilisant la valinomycine, qui est un ionophore sélectif de K +. Une fois ajouté à la valinomycine liposomes en suspension, comme une molécule hydrophobe, permet d'insérer dans la membrane du liposome, transporter passivement K +, et par conséquent de dissiper la membrane ΔΨ potentiel.