In vitro Investigación de la bomba de salida MexAB De Pseudomonas aeruginosa

1. Producción y Purificación de Proteínas MexA, MexB de Pseudomonas aeruginosa Transformar los plásmidos que albergan los genes MexA y MexB en una E. coli cepa de producción (por ejemplo, C43 DE3). Placa en LB agar suplementado con el antibiótico apropiado. Elija una sola colonia para inocular un cultivo previo de O / N. A la mañana siguiente, inocular el precultivo en 1 l de LB y crecer a 37 ° C con agitación (240 rpm). Una vez que las células han alcanzado la fase exponencial (OD 600 = 0,6-0,8) inducen con IPTG 1 mM. Realizar la inducción durante 2-3 horas a 30 º C bajo agitación. Centrifugar las células (9.000 xg durante 20 min) y se resuspende en 30 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM. Interrumpir las células usando una prensa francesa (10.000 psi, 4 pasadas). Desechar las células sin romper y los cuerpos de inclusión por centrifugación a 9000 xg durante 20 min. Membranas de pellets de 1 hora a 100.000 xg yresuspend cada sedimento en 30 ml de Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol al 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM. Determinar la concentración total de proteínas de membrana utilizando el ensayo colorimétrico BCA y solubilizar las membranas o / n con 2% de dodecil maltósido (DDM) en un volumen final determinado de modo que el detergente: proteína es 1:1,5 (W / W). Ultracentrífuga a 100.000 xg durante 1 hora para descartar material no solubilizado y agregada. Incubar el sobrenadante durante 2 horas a 4 ° C con una resina de níquel (purificación MexA) o una resina de cobalto (purificación MexB) equilibrada con Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol al 5% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. Vierta la resina en una columna vacía. Recoger el flujo a través. Lavar la resina con 50 ml de Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol al 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM, a continuación, con 25 ml de Bis-Tris 10 mM pH 6, glicerol 5% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. Eluir la protein con 20 ml de Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol al 5% (w / v), imidazol 300 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. Se concentra la proteína con un dispositivo de ultrafiltración a 3 ml y la carga sobre una columna de desalación equilibrada con un tampón de imidazol-libre. Justo antes de la reconstitución (ver más adelante), las proteínas solubilizadas ultracentrifugar (100.000 xg durante 20 minutos) para deshacerse de los lípidos y las proteínas no solubilizada. A continuación concentrar la proteína de nuevo a 0,3 ml. Bacteriorhodopsin de Halobacter Salinarium Se cultivan las células Salinarium Halobacter bajo iluminación a 37 ° C durante 10 días en un medio de crecimiento líquido que contiene NaCl 4 M, MgSO4 150 mM, citrato 10 mM, KCl 30 mM, extracto de levadura 5 g / l, y la peptona 5 g / L. Interrumpir las células mediante diálisis frente a agua desionizada. Purificar la membrana púrpura en un 30-40% (w / v) de sacarosa gradiente (100.000 xg durante 17 horas). Solubilizar la suspensión de membrana con 2% octylglucósido durante 24 horas a 37 º C (volumen para la solubilización con el fin de resuspender la membrana a una 02:01 (w / w) de detergente: proteína). Calcule la concentración de BR solubilizado utilizando ε (570 nm) = 54.000 M -1 cm -1. Justo antes de la reconstitución (ver abajo), ultracentrifugar la BR solubilizado (100.000 xg durante 20 minutos) para deshacerse de los lípidos y las proteínas no solubilizada. Nota: Las membranas nativas se enriquecen de forma natural en BR así que no hay más purificación. 2. Preparación de proteoliposomas Formación de liposomas: Poner 400 l de DOPC disueltos en cloroformo (25 mg / ml) en un vaso de precipitados de vidrio y añadir 1,5 mg de colesterol almacenado como un polvo. Seque justo antes de la manipulación bajo una corriente de nitrógeno o vacío durante al menos 1 hora en un vaso de vidrio. El DOPC: relación molar de colesterol es 3,3:1. Después de que se hayan secado, hidratar los lípidos con 1 ml de HEPES 25 mM pH 7,K 2 SO 4 100 mM, MgCl2 2 mM, 2 mM piranina. La suspensión debería aparecer turbia en esta etapa. Calentar la solución durante 10 min a 37 ° C. Someter a ultrasonidos durante 10 minutos a 40 W con 30 pulsos seg, 30 ciclos de pausa seg a TA. La suspensión debe ser transparente en esta etapa. Para obtener una población de liposomas monodisperso, realizar dos ciclos de extrusión y para cada ciclo, pasar la suspensión de liposomas a través del filtro al menos 11x. Para el primer ciclo, utilizar un tamaño de poro de la membrana de 200 nm y para el segundo ciclo, utilizar un tamaño de poro de la membrana de 100 nm. Mediciones de dispersión dinámica de la luz se pueden realizar en este paso para comprobar la homogeneidad de la suspensión. Incorporación de proteínas Principio: Las proteínas de membrana se pueden reconstituir en liposomas gracias al efecto solubilizante de los detergentes. Liposomas solubilizados-detergente se incuban con la proteína de membrana solubilizada con detergente y la formación de la proteoliposomes se desencadena por la rápida eliminación del detergente con perlas de poliestireno 9. Añadir 28 mg de Triton X-100 (0,56% final) y se incuba O / N a 4 ° C (la temperatura de solubilización se puede adaptar a la proteína en estudio). Añadir la proteína solubilizada con detergente (BR, MexB y MexA) a los liposomas solubilizados e incubar 15 min a 4 ° C. Añadir las proteínas de la suspensión de liposomas solubilizados en las siguientes proporciones (W / W): lípidos / MexB = 20, MexB / MexA = 2,5, y los lípidos / BR = 30. Añadir perlas de poliestireno en un 30:1 cuentas: cociente detergente (w / w, teniendo en cuenta el peso total del detergente, incluyendo detergente añadido con las proteínas purificadas) e incubar 5 horas, en la oscuridad (por la BR) a TA en una suave agitación. Antes de este procedimiento, activar los BioBeads con metanol y la incubación etanol y ampliamente lavar con agua. Se purifica la proteína proteoliposomas y sustratos libres utilizando un PD-10columna de desalación equilibrada con HEPES 25 mM pH 7, K 2 SO 4 100 mM y MgCl 2 2 mM. Guarde las proteoliposomas a 18 ° C en la oscuridad durante un máximo de 2-3 semanas. Evaluación de la eficacia de la reconstitución en gradiente de sacarosa. Para comprobar que tanto el MexB y la BR han reconstituido en liposomas, purificar la suspensión proteoliposoma en un gradiente discontinuo de sacarosa. Asentarse suavemente los proteoliposomas en un gradiente de cinco capas de sacarosa (60%, 20%, 10%, 5%, y 2,5%, w / v). Ultracentrífuga durante 17 horas a 100.000 xg (con aceleración mínima y deceleración). Recoger cuidadosamente las diversas fracciones de gradiente (especialmente las interfaces entre cada capa de sacarosa) y analizarlas en SDS-PAGE (10%) mediante la tinción de Coomassie o transferencia Western. Agregados de proteínas se encuentran en la parte inferior del tubo, mientras que las proteínas no incorporado, solubilizada con detergente se encuentran en la parte superior deel tubo. Proteoliposomas y liposomas se encuentran en las interfaces de sacarosa que corresponden a su densidad intrínseca. Liposomas vacíos se recuperaron más arriba en el gradiente de las proteoliposomas. 3. La fluorescencia de medición Realizar mediciones de fluorescencia a 25,0 º C usando un espectrofluorómetro permitiendo mediciones de doble longitud de onda (lámpara de Xe, 150 W). Períodos de iluminación alternativos (para activar BR con longitudes de onda de excitación / emisión de 550 nm / 550 nm) y mediciones de fluorescencia con las longitudes de onda de excitación / emisión de 455 nm / 509 nm durante 2 segundos para medir la fluorescencia de la piranina. Ajuste los anchos de banda de excitación y emisión de 5 nm. Llevar a cabo las mediciones en presencia de 50 nM valinomicina para evitar la formación de un potencial de membrana ΔΨ inversa. Nota: De hecho, debido a que el BR bombea protones, hay más cargas positivas en el interior del liposoma que en el exterior. Esta cargagradiente se puede descartar el uso de valinomicina, que es un ionóforo selectivo de K +. Una vez añadido a la valinomicina liposomas suspensión, como una molécula hidrofóbica, se inserte en la membrana del liposoma, transportar pasivamente K +, y por lo tanto disipar el potencial de membrana ΔΨ.