In-vitro-Untersuchung der MexAB Effluxpumpe Von Pseudomonas aeruginosa

1. Produktion von rekombinanten Proteinen Mexa, MexB aus Pseudomonas aeruginosa Transformieren Sie die Plasmide, die MEXA und MexB Gene in einem E. coli-Produktionsstamm (zB C43 DE3). Platte auf LB-Agar-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt. Wählen Sie eine einzelne Kolonie, um eine O / N Vorkultur zu impfen. Am nächsten Morgen, impfen die Vorkultur in 1 l LB und wachsen bei 37 ° C unter Rühren (240 UpM). Sobald die Zellen die exponentielle Phase erreicht (OD 600 = 0,6-0,8) induziert mit 1 mM IPTG. Führen Induktions für 2-3 Stunden bei 30 ° C unter Rühren. Zentrifugenzellen (9.000 × g für 20 min) und Resuspension in 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM. Stören Zellen mit einer Französisch Presse (10.000 psi, 4 Pass). Entsorgen ungebrochen Zellen und Einschlusskörper durch Zentrifugation bei 9.000 g für 20 min. Pellet-Membranen 1 h bei 100.000 xg und resuspend jedes Pellet in 30 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 20% Glycerin (w / v), 10 mM Imidazol, 500 mM NaCl. Bestimmung der Gesamtmembranproteinkonzentration unter Verwendung des BCA-kolorimetrischen Assay und Solubilisierung der Membranen O / N bei 2% Dodecylmaltosid (DDM) in einem Endvolumen bestimmt, so daß Reinigungsmittel: Protein 1:1,5 (w / w). Ultrazentrifuge bei 100.000 g für 1 Stunde an nicht gelösten und aggregiertes Material verwerfen. Inkubieren der Überstand für 2 Stunden bei 4 ° C mit einer Nickel-Harz (Mexa Reinigung) oder einer Kobalt-Harz (MexB Reinigung) mit Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 5% Glycerin äquilibriert (w / v), 10 mM Imidazol, NaCl 500 mM, DDM 0,2%. Gießen Sie den Harz in einer leeren Spalte. Sammeln Sie die Flow-Through. Waschen des Harzes mit 50 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 20% Glycerin (w / v), 10 mM Imidazol, 500 mM NaCl, DDM 0,2%, dann mit 25 ml Bis-Tris 10 mM pH 6, Glycerin 5% (w / v), 10 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 0,2% DDM. Eluiere das protein mit 20 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 5% Glycerin (w / v), 300 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 0,2% DDM. Konzentrieren des Proteins mit einer Ultrafiltrationsvorrichtung auf 3 ml und Belastung einer Entsalzungssäule mit einem Imidazol-freiem Puffer äquilibriert. Kurz vor der Rekonstitution (siehe unten), Ultrazentrifugation der solubilisierten Proteine ​​(100.000 × g für 20 min), um von Lipiden und Proteinen unsolubilisierte loszuwerden. Dann konzentrieren, die das Protein wieder in 0,3 ml. Bakteriorhodopsin aus Halobacter salinarium Wachsen Halobacter salinarium Zellen unter Beleuchtung bei 37 ° C für 10 Tage in einem flüssigen Wachstumsmedium, das 4 M NaCl, 150 mM MgSO 4, 10 mM Citrat, 30 mM KCl, Hefeextrakt 5 g / l Pepton 5 g / L. Stören Zellen durch Dialyse gegen deionisiertes Wasser. Reinige den Purpurmembran auf einem 30-40% (w / v) Saccharosegradienten (100.000 × g für 17 h). Solubilisierung des Membransuspension mit 2% octylglucoside für 24 h bei 37 ° C (Volumen für die Solubilisierung, um die Membran bei einer 2:1 (w / w) Waschmittel resuspendieren: Protein-Verhältnis). Schätzen Sie die Konzentration der gelösten BR mit ε (570 nm) = 54000 M -1 cm -1. Kurz vor der Rekonstitution (siehe unten), Ultrazentrifugation des solubilisierten BR (100.000 × g für 20 min), um von Lipiden und Proteinen unsolubilisierte loszuwerden. Hinweis: Die nativen Membranen sind natürlich in BR angereichert, so dass keine weitere Reinigung erforderlich ist. 2. Herstellung von Proteo Liposomenbildung: Setzen 400 ul DOPC in Chloroform (25 mg / ml), gelöst in einem Becherglas und füge 1,5 mg Cholesterin als Pulver gelagert. Trocknet sie kurz vor Manipulation unter einer Stickstoff-oder Dampfdruck von mindestens 1 Stunde in einem Becherglas. Die DOPC-Cholesterin-Stoffmengenverhältnis 3,3:1. Nachdem sie getrocknet wurden, hydratisieren die Lipide mit 1 ml 25 mM HEPES pH 7,K 2 SO 4 100 mM, MgCl 2 2 mM, 2 mM Pyranin. Die Suspension sollte in diesem Stadium trüb erscheinen. Die Lösung wird für 10 min bei 37 ° C. Beschallen für 10 min bei 40 W mit 30 sec Puls, 30 s Pause Zyklen bei RT. Die Suspension sollte in dieser Phase klar erscheinen. Um eine monodisperse Population von Liposomen zu erhalten, führen Sie zwei Zyklen der Extrusion und für jeden Zyklus, vorbei an der Liposomensuspension durch den Filter mindestens 11x. Für den ersten Zyklus, verwenden eine Membranporengröße von 200 nm und für den zweiten Zyklus, verwenden eine Membranporengröße von 100 nm auf. Dynamische Lichtstreuungsmessungen kann bei diesem Schritt durchgeführt, um die Homogenität der Suspension zu überprüfen. Protein-Aufnahme Prinzip: Membranproteine ​​können in Liposomen dank der machende Wirkung von Reinigungsmitteln aufgelöst werden. Detergens-solubilisierten Liposome mit dem Detergens-solubilisierten Membranproteins und die Bildung der p inkubiertroteoliposomes wird durch schnelle Beseitigung der Reinigungsmittel mit Polystyrol-Kügelchen 9 ausgelöst. In 28 mg Triton X-100 (0,56% endg.) und Inkubation O / N bei 4 ° C (der Solubilisierung Temperatur auf das Protein untersucht, angepasst werden). Hinzufügen des Detergens-solubilisierten Protein (BR, MexB und Mexa) mit den Liposomen solubilisiert und Inkubation 15 min bei 4 ° C. Hinzufügen der Proteine ​​an solubilisierten Liposomensuspension in den folgenden Verhältnissen (w / w): Lipide / MexB = 20, MexB / Mexa = 2,5 und Lipide / BR = 30. In Polystyrol-Kügelchen auf einen 30:1-Perlen: Reinigungsmittel-Verhältnis (w / w, wenn man bedenkt, das Gesamtgewicht des Reinigungsmittels, einschließlich Reinigungsmittel mit den gereinigten Proteinen aufgenommen) und Inkubation 5 Stunden, in der Dunkelheit (wegen der BR) bei RT unter leichtem Rühren. Vor dieser Prozedur, aktivieren Sie die BioBeads mit Methanol und Ethanol Inkubation und ausgiebig mit Wasser zu waschen. Reinige den Proteo Protein und freien Substraten unter Verwendung einer PD-10Entsalzungssäule mit 25 mM HEPES pH 7, K 2 SO 4 äquilibriert, 100 mM MgCl 2 und 2 mM. Bewahren Sie die Proteo bei 18 ° C in der Dunkelheit für bis zu 2-3 Wochen. Bewertung der Wirksamkeit der Rekonstitution auf Saccharosegradienten. Um zu überprüfen, dass sowohl die MexB und der BR in Liposomen rekonstituiert wurde, reinigen das Proteoliposom Suspension auf einem diskontinuierlichen Saccharose-Gradienten. Die Proteo Sanft setzen sich auf einem Fünf-Schicht-Gradienten von Saccharose (60%, 20%, 10%, 5% und 2,5%, w / v). Ultrazentrifuge für 17 h bei 100.000 xg (mit minimalen Beschleunigungs-und Verzögerungsraten). Sorgfältig sammeln die verschiedenen Gradientenfraktionen (insbesondere die Schnittstellen zwischen jeder Schicht von Saccharose) und unter Verwendung von Coomassie-Färbung oder Western-Blot analysiert werden auf SDS-PAGE (10%). Aggregierten Proteine ​​werden an der Unterseite des Rohres festgestellt, während nonincorporated, Waschmittel-solubilisierten Proteine ​​werden an der Spitze gefundendas Rohr. Proteo und Liposomen werden in Saccharose-Schnittstellen, die ihre Eigendichte entsprechen gefunden. Leere Liposomen werden weiter oben in der Steigung als die Proteo erholt. 3. Fluoreszenzmessung Fluoreszenzmessungen durchzuführen bei 25,0 ° C mit einem Spektrofluorometer, so dass für Dual-Wellenlängen-Messungen (Xe-Lampe, 150 W). Alternative Beleuchtungsperioden (BR mit Anregungs / Emissionswellenlängen von 550 nm / 550 nm zu aktivieren) und Fluoreszenzmessungen mit Anregungs / Emissionswellenlängen von 455 nm / 509 nm für 2 Sekunden, um die Fluoreszenz zu messen Pyranin. Einstellen der Anregungs-und Emissionsbandbreiten bis 5 nm aufweist. Führen die Messungen in der Anwesenheit von 50 nM Valinomycin, um die Bildung einer umgekehrten Membranpotential ΔΨ zu verhindern. Anmerkung: In der Tat, da der BR Protonen-Pumpen gibt es mehr positive Ladungen innerhalb der Liposomen als außerhalb. Diese GebührGradienten können mit Valinomycin verworfen werden, was eine selektive K +-Ionophor ist. Sobald auf die Liposomen-Suspension zugesetzt Valinomycin, ein hydrophobes Molekül, in die Liposomenmembran einzusetzen, passiv transportiert K +, und somit das Membranpotential abzuleiten ΔΨ.