In vitro onderzoek naar de MexAB Efflux Pomp Van Pseudomonas aeruginosa

1. Eiwit productie en zuivering Mexa, MexB van Pseudomonas aeruginosa Transformeer de plasmiden de Mexa en MexB genen in een E. coli productie stam (bijv. C43 DE3). Plaat op LB Agar medium aangevuld met de juiste antibiotica. Kies een kolonie van een O / N precultuur te enten. De volgende ochtend, beënt de voorkweek in 1 L LB en groeien bij 37 ° C onder schudden (240 rpm). Zodra de cellen de exponentiële fase bereikt (OD 600 = 0,6-0,8) induceren met 1 mM IPTG. Voer inductie gedurende 2-3 uur bij 30 ° C onder roeren. Centrifugeer cellen (9000 g gedurende 20 min) en resuspendeer in 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, 150 mM NaCl. Verstoren cellen met behulp van een Franse pers (10.000 psi, 4 pas). Gooi gebroken cellen en insluitingslichaampjes door centrifugeren bij 9000 xg gedurende 20 minuten. Pellet membranen 1 uur bij 100.000 xg en resuspend elke pellet in 30 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol 20% (w / v), 10 mM imidazool, 500 mM NaCl. Bepaal het totale membraan eiwitconcentratie met de BCA colorimetrische assay en oplosbaar membranen O / N met 2% dodecylmaltoside (DDM) in een eindvolume zodanig bepaald dat detergens: eiwit 1:1,5 (gew / gew). Ultracentrifuge bij 100.000 xg gedurende 1 uur aan niet oplosbaar en geaggregeerd materiaal weggooien. Incubeer het supernatant gedurende 2 uur bij 4 ° C met een nikkel hars (Mexa zuivering) of kobalt hars (MexB zuivering) geëquilibreerd met Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 5% glycerol (w / v), 10 mM imidazool, NaCl 500 mM, DDM 0.2%. Giet de hars in een lege kolom. Verzamel de Flow Through. Was de hars met 50 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol 20% (w / v), 10 mM imidazool, 500 mM NaCl, 0,2% DDM, daarna met 25 ml Bis-Tris 10 mM pH 6, glycerol 5% (w / v), 10 mM imidazool, 500 mM NaCl, 0,2% DDM. Elueer het pprotein met 20 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 5% glycerol (w / v), 300 mM imidazool, 500 mM NaCl, 0,2% DDM. Concentreer het eiwit met een ultrafiltratie-inrichting tot 3 ml en belasting op een ontzoutingskolom geëquilibreerd met een imidazool-vrije buffer. Vlak voor reconstitutie (zie hieronder), ultracentrifuge de opgeloste eiwitten (100.000 g gedurende 20 min) om zich te ontdoen van lipiden en eiwitten unsolubilized. Concentraat vervolgens de proteïne opnieuw 0,3 ml. Bacteriorhodopsin van Halobacter Salinarium Groeien Halobacter Salinarium cellen onder belichting bij 37 ° C gedurende 10 dagen in een vloeibaar kweekmedium dat 4 M NaCl, 150 mM MgSO4, 10 mM citraat, 30 mM KCl, gistextract 5 g / L, pepton en 5 g / L. Verstoren cellen door dialyseren tegen gedemineraliseerd water. Zuiver het purperen membraan op een 30-40% (w / v) sucrose gradiënt (100.000 xg gedurende 17 uur). Oplosbaar membraan suspensie met 2% octylglucOside gedurende 24 uur bij 37 ° C (volume voor het oplosbaar om het membraan te resuspenderen in een 2:1 (w / w) detergens: eiwitverhouding). Schat de concentratie van opgeloste BR met ε (570 nm) = 54.000 M-1 cm -1. Vlak voor reconstitutie (zie hieronder), ultracentrifuge het opgeloste BR (100.000 xg gedurende 20 min) om zich te ontdoen van lipiden en eiwitten unsolubilized. Opmerking: De natieve membranen natuurlijk verrijkte BR dus geen verdere zuivering nodig. 2. Bereiding van proteoliposomen Liposoomvorming: Put 400 gl DOPC opgelost in chloroform (25 mg / ml) in een bekerglas en voeg 1,5 mg cholesterol opgeslagen als een poeder. Droog ze net voor manipulatie onder een stoom van stikstof of vacuüm ten minste 1 uur in een glazen beker. De DOPC: cholesterol molaire verhouding 3,3:1. Nadat ze gedroogd, hydrateren de lipiden met 1 ml 25 mM HEPES pH 7,K 2 SO 4 100 mM, 2 mM MgCl2, 2 mM pyranine. De suspensie moet troebel lijken in dit stadium. Verwarm de oplossing gedurende 10 min bij 37 ° C. Sonificeer 10 min bij 40 W met 30 seconden puls, 30 sec pauze cycli bij kamertemperatuur. De schorsing moet duidelijk blijken in dit stadium. Om een ​​monodisperse populatie van liposomen te verkrijgen, voeren twee cycli van extrusie en voor elke cyclus, passeren de liposoomsuspensie door het filter minstens 11x. Voor de eerste cyclus gebruikt een poriegrootte van 200 nm en de tweede cyclus, gebruikt een poriegrootte van 100 nm. Dynamische Lichtverstrooiing metingen in deze stap worden uitgevoerd om de homogeniteit van de suspensie controleren. Eiwit incorporatie Principe: membraaneiwitten kunnen worden gereconstitueerd in liposomen dankzij de solubiliserende effecten van detergentia. Wasmiddel-oplosbaar liposomen worden geïncubeerd met detergens gesolubiliseerde membraan eiwit en vorming van de proteoliposomes wordt veroorzaakt door een snelle eliminatie van het wasmiddel met polystyreen parels 9. Voeg 28 mg Triton X-100 (0,56% eind) en geïncubeerd O / N bij 4 ° C (het oplossen temperatuur kan worden aangepast aan het eiwit worden onderzocht). Voeg de detergens gesolubiliseerde eiwit (BR, MexB en Mexa) om het opgeloste liposomen en incubeer 15 minuten bij 4 ° C. Voeg de eiwitten aan het opgeloste liposoomsuspensie in de volgende verhoudingen (gewicht / gewicht): lipiden / MexB = 20, MexB / Mexa = 2,5 en lipiden / BR = 30. Voeg polystyreen beads een 30:1 kralen: detergens verhouding (w / w, gezien het totale gewicht van het wasmiddel, zoals detergens met de gezuiverde eiwitten) en incubeer 5 uur in het donker (vanwege de BR) bij kamertemperatuur onder zachtjes roeren. Voorafgaand aan deze procedure activeert de biobeads met methanol en ethanol incubatie en uitgebreid wassen met water. Zuiver het proteoliposomen eiwit en gratis substraten met behulp van een PD-10ontzoutingskolom geëquilibreerd met 25 mM HEPES pH 7, K 2 SO 4 100 mM MgCl2 en 2 mM. Bewaar de proteoliposomen bij 18 ° C in het donker gedurende 2-3 weken. Beoordeling van de reconstructie werkzaamheid op sucrosegradiënt. Om te controleren dat zowel de MexB en de BR zijn gereconstitueerd in liposomen, zuiveren de proteoliposome schorsing op een discontinue sucrosegradiënt. Voorzichtig vestigen de proteoliposomen op vijf lagen gradiënt van sucrose (60%, 20%, 10%, 5% en 2,5%, w / v). Ultracentrifuge voor 17 uur bij 100.000 xg (met minimale versnelling en vertraging tarieven). Zorgvuldig verzamelen verschillende gradiënt fracties (met name de interfaces tussen elke laag sucrose) en analyseren op SDS-PAGE (10%) met Coomassie kleuring en Western blotting. Geaggregeerde eiwitten worden gevonden op de bodem van de buis, terwijl nonincorporated, detergens gesolubiliseerde eiwitten gevonden bovenaande buis. Proteoliposomen en liposomen zijn te vinden op sucrose interfaces die overeenkomen met hun intrinsieke dichtheid. Lege liposomen worden verder hersteld in de helling dan de proteoliposomen. 3. Fluorescentiemeting Voer fluorescentie metingen bij 25,0 ° C met een spectrofluorometer waardoor dual-golflengte metingen (Xe-lamp, 150 W). Afwisselende periodes verlichting (BR met excitatie / emissie golflengte van 550 nm / 550 nm te activeren) en fluorescentie metingen met excitatie / emissie golflengte van 455 nm / 509 nm 2 seconden ingedrukt om de pyranine fluorescentie meten. Stel de excitatie en emissie bandbreedtes tot 5 nm. Voer de metingen in de aanwezigheid van 50 nM valinomycine de vorming van een omgekeerde membraanpotentiaal ΔΨ voorkomen. Opmerking: Inderdaad, omdat de BR pompen protonen er meer positieve ladingen binnenin het liposoom dan buiten. Deze kostengradiënt kan worden weggegooid met valinomycine, een selectieve K + ionofoor. Eenmaal toegevoegd aan de liposomen suspensie valinomycine, een hydrofoob molecuul, wordt ingevoegd in de liposoommembraan, passief transport K +, en dus verdwijnen de membraanpotentiaal ΔΨ.