Травмы парадигмы использования Drosophila личиночной брюшной нервной расследовать центральной нервной системы регенерации и ремонта описаны. Stabbing последующей лазерной сканирующей конфокальной микроскопии в замедленной и фиксированного образца, в сочетании с количественным анализом с целенаправленно разработанного программного обеспечения и генетики, используются для изучения молекулярных механизмов центральной нервной системы регенерации и репарации.
Экспериментальный метод был разработан для исследования клеточных реакций на центральную нервную систему (ЦНС), травмы помощью плодовой мушки дрозофилы. Ремонт взаимопонимании и регенерации у животных, является ключевым вопросом в биологии. Поврежденной центральной нервной системы человека не регенерирует, и понимание того, как способствовать регенерации является одной из главных целей медицинской неврологии. Мощный генетический инструментарий Drosophila может быть использован для решения проблемы регенерации ЦНС.
Поражение в ЦНС брюшной нервной (VNC, что эквивалентно позвоночных спинного мозга) наносится вручную с вольфрамовой иглой. VNC впоследствии может быть снят в замедленной помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии в течение 24 часов следить за развитием поражения с течением времени. Кроме того, он может быть культурным, а затем фиксировали и окрашивали использованием иммунофлюоресценции для визуализации нейронов и глиальных клеток с конфокальной микроскопии. Используя соответствующие маркеры, чаnges в морфологии клеток и их состояния в результате травмы могут быть визуализированы. С ImageJ и специально разработанные плагины, количественный и статистический анализ может быть выполнен для измерения изменений в рану размером с течением времени и последствий травм в клеточной пролиферации и гибели клеток. Эти методы позволяют анализировать большие размеры образца. Они могут быть объединены с мощными генетике дрозофилы исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе CNS регенерации и репарации.
Регенерация у животных показывают, что клетки чувствуют, когда организм роста заказать и полный, и как структурную целостность организма достигается и поддерживается. Понимание этих загадочных способностей клеток представляет большой интерес в биологии. Содействие регенерации является одной из ключевых целей для медицинских нейронаук. У людей, поврежденных центральной нервной системы (ЦНС), не восстанавливаются. Грызун модели травмы спинного мозга используются понять, как клетки реагируют на травмы. Тем не менее, этические проблемы, высокая стоимость и медленный цикл жизни животных сдерживать прогресс.
Плодовой мушки Drosophila широко используется модель организма в биологии развития и нейронауки. Благодаря своей мощной генетических инструментов и короткий жизненный цикл, Drosophila была в очередной привели к открытию гена функций и генных сетей, имеющих отношение к пониманию человека и болезни. Существует множество доказательств эволюционного консохранения функции гена от мух до человека.
За последние годы несколько парадигм для нервной системы травмы были созданы в дрозофилы. Некоторые состоят из повреждения периферических нервов, которые расположены вдоль крыла или аксотомии периферических нервов, в том числе сенсорные 1 и двигатель аксонов 2. Тем не менее, периферической и центральной нервной системы отличаются во многих отношениях, и это хорошо известно, что у многих животных периферическая нервная система может восстанавливаться в то время как в ЦНС не может. Таким образом, чтобы понять, центральной нервной системы регенерации, прямой ущерб в ЦНС является более целесообразным. Stabbing травмы иглой была успешно применена к мозгу взрослого Drosophila расследовать ответ на повреждение 3,4. Используя другой подход, Аяз и соавт. Разорвал ЦНС аксоны в культуре мозг взрослого с Piezo власти microdissector, и проанализировал их регенерации в течение 4 дней 5. Преимущество этих более поздних экспериментальной установки иPS то, что они сосредоточены на мозг, который, несомненно, представляет большой интерес. Недостатком является то, что мозг является гораздо более сложным, чем VNC, которая имеет дело только с двигателем и сенсорное управление. Работа на мозг взрослого человека также является более трудоемким. Личинка готов для экспериментов в 4 дня, в то время как она занимает около 10 дней для вылета имаго, а затем еще 5 дней для их созревания. Взрослом мозге также более трудно справиться, потому что она заключена в толстой кутикулой, которые трудно удалить. VNC имеет дальнейшего привлечения быть функционально эквивалентны позвоночных спинного мозга.
Личинки дрозофилы широко используется в качестве модельного организма для неврологии 6-9. Хотя, строго говоря личинка находится в стадии развития, она также может считаться полностью функциональный животных. Личинка имеет передвижения, в том числе несколько чувства обоняния, вкуса и ноцицепции и обучения и памяти. Таким образом, личиночных VNC Wкак выбрано в качестве идеальной модели для травм ЦНС.
Личинки и куколки VNCs можно разрезать и культивировали в блюдо, сохраняя целостность сотовых до 24 ч 10. Это предполагает, что травмы могли быть применены к VNC, которые затем могут быть записаны в замедленной за этот период времени, или культивировать и фиксируется на любой желаемый момент времени, в течение этого периода.
Здесь мы приводим экспериментальные парадигмы ЦНС травмы использованием Drosophila личиночной VNC. VNC сначала расчлененный от личинки, и колоть травма наносится вручную с вольфрамовой иглой. VNC помещается на стеклянным дном покровное, и снимали с покадровой лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Кроме того, VNCs может быть культивировали в течение требуемого периода времени, и сотовые последствия травмы могут быть проанализированы в фиксированных экземпляров использовании иммуноокрашивания и конфокальной микроскопии. Области раны могут быть измерены, и количественный анализ клеточного нюmber (клеточной пролиферации и гибели клеток) может быть осуществлено с специально разработанного программного обеспечения. Большие размеры образца может быть легко обрабатывается, в результате статистически подтверждено результатами. Эти методы были успешно сочетается с мощным генетике дрозофилы, чтобы обнаружить ген сети, лежащей в основе глиальных регенеративного ответа на ЦНС травмы 11.
Мы создали протокол за нанесение ножевых ранений травм Drosophila личиночной ЦНС для исследования клеточных реакций на травму, восстановления и регенерации. Личинок VNCs расчленены и нанес удар, после которого они сняты с покадровой микроскопии или фиксируется на флуоресценцию иммуноокрашивания для визуализации глии и нейронов, апоптоз, или клеточное деление. Прогрессирование поражения с течением времени могут быть измерены. Этот метод сопровождается специально разработанное программное обеспечение для количественного и статистического анализа клеточных изменений на количество травм и во время ремонта.
Мы зарезали 96-часовой AEL личинок (а это были либо фиксированными или позволили разработать далее), стадии развития до перехода в куколку, а затем взрослые мухи. В 96 часов, VNCs являются достаточно большими для колющих, они находятся в середине третьего этапа возраста, и, таким образом, не проходит окукливания еще и нервная система уже полностью функциональный похож на объявлениеУльт. Можно было бы ударить чуть позже у личинок и точные сроки должны быть выбраны в соответствии с исследования вопроса. Однако, в зависимости от вопросов, рассматриваемых, это вообще будет необходимо культуры VNCs в течение некоторого времени наблюдать за клеточный ответ на травму. Некоторое время после 120 часов начинается AEL окукливания, в период, когда ЦНС реконструированы и, таким образом, лучше избегать. Таким образом, временное окно для колющих плюс культура в личинки довольно ограничены. Использование личинки по-прежнему имеет большое техническое преимущество по сравнению с использованием взрослых: в то время, как и взрослые, нервная система уже полностью функциональным, анализируя ответ на повреждение значительно проще и быстрее в личинок.
При сравнении размеров и морфологии мозга и VNCs расчлененных и культивировали в блюдо VNCs, что расчленены на эквивалентную позднее время без культивирования в блюдо, кажется, что развитие идет медленнее, в культуре, чем в естественных условиях. В других отношениях,развитие продолжается обычно в области культуры, целостность тканей сохраняется, и клетки живых показывает несколько ответов. Рана расширения, нейропиле ремонт и пролиферации глиальных состоится в течение 22 часов после поножовщины. Это показывает, что клеточный ответ на травмы происходят в культуре и есть, скорее всего, не нужно для поддержания эксплантов дольше, чем один день. Если долгосрочной перспективе культуры желаемого, протокол может потребовать дальнейшей оптимизации, такие как использование вставки культуры пластины 5.
Важно определить хорошего качества образцов от тех, вырождается. Оптимизация этого протокола требует некоторого навыка и вырождение неизбежно будут возникать в некоторых образцах. VNC может приобрести «цветной капусты» внешний вид, что отражает распад целостности ткани (рис. 5В). Вырождение признается также вакуолизация VNC независимо от ножевых ран, которые могут присутствовать в неповрежденном, не зарезал образцов (рис. 5C </strОнг>). Эти образцы должны быть уничтожены. Вырождение, скорее всего, вызвана грубым вскрытие, которое может разорвать нервы и защитный слой поверхности глии. Таким образом, большое внимание должно быть принято рассекать осторожно. Другие факторы, влияющие включают в культуральной среде, которая должна содержаться в чистоте и с антибиотиками, строго придерживаясь моет и тайминги, как указано в протоколе. Наконец, длина иглы и иглодержатель, размер и острота иглы очень важны. Иглодержатель могут загрязнять среду культивирования и тупой иглой может привести к большим травмам, которые не могут восстановить себя и приведет к вырождению. Важно регулярно поддерживать иглу резким.
В этом протоколе, мы воспользовались линии белка ловушки мухи визуализировать нейропиле в параллельной визуализации глиальных процессов с использованием традиционных GAL4-UAS системы. Эти средства также могут быть объединены с другими двоичной системы экспрессии, такие как LeХА 19 и Q-система 20, которая не зависит от GAL4. Это позволило бы анализ взаимодействий, например, между аксонов и глиальных процессов, в ответ на повреждение. При дальнейшем сочетая его с другими генетическими такие инструменты, как репортеры дендритов 21 или приток кальция 22, этот метод дает большие возможности для анализа клеточной биологии за травмы ответ глиальных клеток, аксонов и дендритов в ЦНС. Наконец, этот метод может быть объединен со стандартным генетики, мутации и чрезмерной экспрессии генов, чтобы проверить функции генов в ответ на травму и регенерации.
Этот протокол успешно привели к открытию гена сети, лежащей в основе регенеративной глиальных ответ на ЦНС травмы 11. Учитывая эволюционные сохранения функции гена, распутывая этих клеточных событий и функций генов в фруктовых мух, вероятно, обеспечит значительную способность проникновения в суть понимания маmmalian ЦНС ответ на повреждения и регенерации.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Mei Ann Lim за критическое прочтение рукописи и другие члены нашей лаборатории для их обсуждения на протяжении всей этой работы. Эта работа финансировалась Ямада научного фонда и Королевского общества Короткий визит стипендий и ЕС Мари Кюри международного входящего GRR стипендий для KK, и BBSRC гранта (BB/H002278/1) и Wellcome Trust Оборудование Грант (073228/Z/03/Z) в AH
Equipment | |||
Staining block | Brunel Microscope | ||
Forceps No. 5 | e.g. Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
Reagent | |||
Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
FBS | Sigma | F7524 | |
Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 |