Een blessure Paradigm aan het centrale zenuwstelsel Reparatie Onderzoek in<em> Drosophila</em

1. Het verzamelen van Geënsceneerde Larven Plaats 15 vrouwelijke en 15 mannelijke volwassen vliegen in een cilindrische perspex kooi om eieren te leggen op een petrischaal met agar en druivensap aangevuld met een kleine lepel van gist pasta voor 3 uur bij 25 ° C. Wijzig de plaat 3-4 keer per dag, en gooi de eerste plaat (dwz van de O / N ei-lay). Gooi ook de platen vanaf de eerste dag. Vanaf de tweede dag, houden de platen met eieren bij 25 ° C. Na 7 dagen van het verzamelen van eieren, te beginnen met een nieuwe set-up van ouders vliegen. Na ongeveer 24 uur, larven uit de eieren. Door het inhaken larven met een kwast of verdund met een pincet, transfer 35 larven van de druif agar aan een houder die standaard fly voedsel (10 ml) (Figuur 1A). Houd de injectieflacons met larven gedurende 3 dagen (96 uur na de eileg, AEL) bij 25 ° C. 2. Dissectie van larven ventrale zenuw Snoeren voor Cultuur Reinig wordennch en handen met 70% ethanol. Geniet van 4 vlekken blokken, 2 paar pincet en een naald met 70% ethanol, en laat drogen aan de lucht. Bereid 4 kleuring blokken met de volgende media: een met gedestilleerd water (DW) te reinigen en te bundelen schoongemaakt larven, een tweede met 2 ml Shield en Sang M3 insecten medium met 1% penicilline en streptomycine, Ecdysone-vrij (M3 PS medium) aan de larven ontleden en een derde met 2 ml M3 PS medium te bundelen ontleed ventrale zenuw koorden (VNCs) en een vierde met 2 ml M3 PS medium te steken de VNCs. Alle reagentia moeten worden voorverwarmd tot kamertemperatuur. Voeg water toe aan de injectieflacon met 96 uur AEL larven. Vervolgens met een spatel uitgespreid voedsel met larven van de flacon op een natte papieren handdoek. Breng 10 larven naar een kleuring blok met DW te wassen het voedsel. Vervang DW 6 keer. Vervang vervolgens met M3 PS medium. Transfereren van de larven om vlekken blok met 2 ml M3 PS medium. Onder een ontleedmicroscoop, dizorgvuldig ssect een schaal hersenen met behulp van standaard werkwijzen 12, maar tot weefselbeschadiging te minimaliseren, extra voorzichtig te werk gaat als volgt. Plaats de larve dorsale kant naar boven, en houd de dorsale zijde op een derde van het voorste uiteinde met 2 paar pincet (een in elke hand). Terwijl die de voorste gedeelte weg te trekken het achterste uiteinde met de tang, en scheur de opperhuid. De hersenen en de VNC moet zichtbaar vanaf de achterste rand van de voorste helft. Zorgvuldig isoleren van de hersenen en VNC complex door het verwijderen van het vet lichaam, darm en epidermis. Wanneer de VNCs te veel beschadigd is, zal de VNCs zelfs ontaarden geheel of gedeeltelijk, zonder steken letsel. Houd rekening met de volgende punten: Trek niet aan of scheur de imaginaire schijven en perifere zenuwen in de borst VNC omdat dit tot beschadiging van de VNC. Om de perifere zenuwen te snijden, houd de perifere zenuwen met twee paar tang dicht in de buurt van elkaar, en trek vervolgens de zenuwen met de vooreekhoorntjesbrood. Imaginal schijven en monddelen kan worden overgelaten aan de VNC. Laat de ring wartel en lymfeklier aan de hersenen. Snij de darm op het punt het dichtst bij de hersenen, waar weinig voedsel is opgenomen. Door gebruik te maken van een P20 Pipetman met de punt afgesneden en verbreed een beetje, de overdracht van de VNC om een ​​kleuring blok met verse M3 PS medium. Alvorens de VNC eerste pipet omhoog en omlaag het medium gebruikt voor de dissectie om de VNC te plakken aan de tip. 3. Stabbing Letsel aan de Drosophila larven VNC In dit gedeelte wordt beschreven hoe u steken letsel uit te voeren om de VNCs, en gestoken-VNCs voor te bereiden op time-lapse analyse en immunokleuring. Post-steken kweekomstandigheden en de duur worden beschreven in paragraaf 5 (voor time-lapse analyse) en in hoofdstuk 6 (voor immunokleuring). Na pooling genoeg VNCs (4-5 voor time-lapseen meer dan 24 voor immunokleuring), overdracht een VNC om een ​​schone vlekken blok met M3 PS. Plaats de VNC zodat de dorsale neuropile is gezien onder de dissectiemicroscoop (Figuur 1B). Dit is de meest natuurlijke oriëntatie voor VNCs te liggen wanneer het aan de optische kwabben. Stab handmatig met een wolfraam naald onder de dissectie microscoop, van de rugzijde nagenoeg haaks gericht en voor de helft van de abdominale VNC (Figuur 1B). Neem bijzondere aandacht voor het volgende: Stab slechts een keer. Stab totdat de naald de bodem van het glas. Maar wees voorzichtig dat u de naald beschadigen. De stam van de naaldhouder moet het medium niet aan tijdens steken. De wond is niet zichtbaar onder de dissectie microscoop. Opmerking: Stab-letsel niets degeneratie De procedurekan leiden tot cellulaire degeneratie binnen de VNC onderscheiden van de steekpartij laesie. Degeneratie resulteert in gaten in de neuropile en soms gaten waargenomen in de cortex niet-gestoken specimens. Exemplaren met degeneratie die de neuropile of wijdverspreide degeneratie van invloed zijn ook de VNC oppervlak moet worden weggegooid. Degeneratie kan als volgt worden geïdentificeerd: Ruw oppervlak, met name op de laterale / ventrale deel van de thorax, op 22 uur van steken. In extreme gevallen, ziet de VNC staken. Gaten of vacuolen in de thoracale neuropile, die zichtbaar als gaten in achtergrondsignaal met fluorescentie immunokleuring. 4. Onderhoud van Naald en Forceps Regelmatig te controleren of de naald is scherp genoeg. De punt van de naald kan verbogen of stomp zijn na het gebruik van het voor een aantal experimenten. In dit geval, verscherpen de punt met behulp van een Arkansas steen of gelijkwaardig. De uiteinden van de tang moetvoldoen perfect. De tips kan beschadigd raken met het gebruik. In dit geval stelt de spuitkop een Arkansas stenen of equivalent. 5. Cultuur en Time-lapse-opname van Gestoken VNCs G9 13 – – de axonale neuropile in de levende VNC een GFP eiwit trap lijn die alle axonen labelt visualiseren kan worden gebruikt, en alle gliacellen (behalve de middellijn glia) visualiseren gliale driver repoGAL4 kan worden gebruikt om de expressie UASdsRed S197Y 14 reporter. Door kruising G9 vliegt naar UASdsRedS197Y,, repoGAL4 vliegen, VNCs van de nakomelingen larven worden verkregen met groene axonen en rode gliacellen die kan worden opgenomen in levend weefsel. Na pooling vier-vijf VNCs, breng 1 VNC om een ​​schone vlekken blok met 2 ml van M3 PS, en steek de abdominale helft van de VNC, zoals aangegeven in paragraaf 3. Breng de gestoken VNC om een ​​Poly-L-lysine gecoate 3,5 mm met glazen bodem petrischaal met 1 ml van M3PS. Plaats de te VNCs dorsale zijde. Duw de VNC met behulp van de platte kant van een pincet om de VNC te houden aan de schotel. Zachtjes voeg 1 ml M3 PS 15% FBS waardoor de eindconcentratie van 7,5% FBS. Acquire beelden met behulp van laser scanning confocale microscopie. Scan de VNC, het verzamelen van een Z-sectie serie over de gehele dikte. We gebruikten een Leica SP2 omgekeerde confocale microscoop met een temperatuur gecontroleerde klimaatkamer. Een daarmee gelijk te confocale microscoop zou moeten werken, maar het kan nodig optimalisatie van de instellingen voor het scannen. De instellingen voor onze time-lapse confocale microscopie waren als volgt: Temperatuur van klimaatkamer: 25 ° C; 20X objectief met 4 keer zoom; scanmodus xyzt, met 512×512 pixel resolutie, z = 1 micrometer stappen en 1-uur of 2 – uur. De Leica SP2 confocale microscoop heeft een beperking in bestandsgrootte voor het scannen. Met deze instellingen kan acht-negen tijdstippen worden gescand. Metandere confocale microscopen, het moet mogelijk zijn om beeld stacks te verwerven voor langere tijd punten, dat wil zeggen over de spanwijdte van maximaal 24 uur. 6. Cultuur en immunokleuring van Gestoken en Vaste VNCs Bereid een 24-well weefselkweekplaat met 500 pi M3 PS 7,5% FBS per putje. Herhaal dissectie van meer dan 24 VNCs voor een 24-well weefselkweekplaat. Door het gebruik van de P20 Pipetman met de punt cut-off, over te dragen 12 niet-gestoken VNCs van het zwembad naar de cultuur schotel, met behulp van een VNC per putje. Stab de rest van VNCs in het zwembad zoals beschreven in paragraaf 3. Breng elke gestoken VNC om een ​​goed stuk. Plaats de 24-well schaal in de 25 ° C incubator voor een gewenste duur afhankelijk van het experiment. Celintegriteit is ongewijzigd ten minste 24 uur. Na cultuur brengen de 12 VNCs in 250 pi 4% formaldehyde PEM in een 1,5 ml buis met de P20 Pipetman met de punt afgesneden. Vervolgens de fixative wordt zorgvuldig gepipetteerd uit, zorg ervoor dat u de VNCs beschadigen. Een kleine hoeveelheid fixeermiddel voldoende om de monsters te dekken blijven in elke buis. Vervolgens voeg verse fixatief, en schud er voorzichtig mee voor 50 min bij RT. Spoelen 2 maal met 0,3% Triton X PBS, en daarna wassen 2 maal gedurende 10 min met 0,3% Triton X PBS bij kamertemperatuur. Block VNCs door incubatie met 10% normaal geitenserum in 0,3% Triton X PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De monsters kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende ten minste een maand. Incubeer VNCs met primaire antilichamen voor meer dan 20 uur bij 4 ° C. Spoelen 2 maal met 0,3% Triton X PBS, vervolgens 3 keer wassen gedurende 10 minuten met 0,3% Triton X PBS bij kamertemperatuur. Incubeer VNCs met secundaire antilichamen voor meer dan 16 uur bij 4 ° C. Spoelen 2 maal met 0,3% Triton X PBS, vervolgens 3 keer wassen gedurende 10 minuten met 0,3% Triton X PBS bij kamertemperatuur RT (in het donker als met fluorescerende secundaire antilichamen). Vervangen PBS met 50% glycerol: 50% PBS minstens eenuur. Vervang met 80% glycerol: 20% PBS gedurende minstens een uur. Monteer een VNC in een venster gemaakt op 2 lagen cello-tape (ongeveer 0,06 mm) op een microscopie glasplaatje. Stel de oriëntatie, en plaats een dekglaasje (18×18 mm) op het raam. Twee VNCs kan worden gemonteerd op een slede met deze methode. Met behulp van een verscheidenheid aan primaire antilichamen, om letsel verschillende cellulaire reacties kan worden geanalyseerd (bijvoorbeeld veranderingen in het aantal cellen en cel vorm). 7. Gegevens analyseren Met behulp van ImageJ en een bereik van Plugins Als de VNC geen steken los degeneratie, moet het monster worden geteld in voor de analyse, ongeacht de grootte van het defect. Zoals steken met de hand gedaan, de grootte van het defect verschilt per keer. Dus is het belangrijk om statistisch analyseren het effect van steken, zoveel mogelijk. Wound maat opmeten. De grootte van de wond is een indicator voor reparatie 15.De stekende laesie is zichtbaar als verstoken van GFP expressie. Laesie-oppervlakte kan worden gemeten lapse data behulp van vrij verkrijgbare software ImageJ als volgt: Met behulp van ImageJ, opent een stapel confocale beelden van "File" menu, selecteer "Import" en van hieruit selecteer "Afbeelding sequentie". Dit zal de verzameling van afzonderlijke beelden in een stapel. Vervolgens wordt het 'stapelen', te veranderen in een "HyperStack" door te gaan naar "Image" menu, "HyperStack" te selecteren en selecteer vervolgens "Stapel op HyperStack". Stel de voxel grootte met behulp van "Eigenschappen" in "Beeld" menu. In data verkregen met de Leica SP2 confocale microscoop kan de voxelafmeting worden verkregen van de scanning-software en de metadata tekstbestand opgeslagen samen met beelden. Met onze instelling, zoals beschreven in hoofdstuk 3, pixelafmetingen zijn xy = 0,366211 micrometer en z = 0,99709 micrometer. Door het onderzoeken van alle segmenten in een keer punt, trek de maximale omtrek van de laesie met de polygoon-selectie-tool in de werkbalk. Dit is deRegion Of Interest (ROI). Voeg de ROI van de ROI manager door te gaan naar "Analyze" menu, scroll naar beneden en selecteer "Tools" en vervolgens, "ROI manager" en vervolgens op "add". Herhaal dit voor de hele tijd punten. Klik op de "Measure" knop in de ROI-manager om het gebied grootte van elke ROI te verkrijgen. Correctie van de VNC beweging tijdens time-lapse-opnamen. "Stackreg" en "Turboreg" plugins 16 (vanaf de ImageJ website http://rsbweb.nih.gov/ij/ ): deze plugins laten kleine steekproef bewegingen te corrigeren tijdens het time-lapse. Bouw een stapel met een gelijkwaardig vertegenwoordiger optische gedeelte door alle tijdstippen en toepassen van de plugins. Helpt hoe de laesie veranderingen zichtbaar tijd. De details over deze methoden en de handleiding zijn verkrijgbaar bij de onderzoeksgroep die deze plugins ontwikkeld. ( http://bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg /). Automatisch tellen van gliacellen. "DeadEasy glia" plugin ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ): dit is ontwikkeld om het aantal REPO-positieve gliacellen tellen mee in de Drosophila larven VNC en de verandering in de gliale onderzoeken aantal wordt veroorzaakt door steken letsel 17. De plug-in werkt nauwkeurig, met een fout van 0,1% false positives en 4,3% vals negatieven 17. Om deze plug-in, first label gebruik maken van alle glia (met uitzondering van de middellijn) in het monster met behulp van immunofluorescentie met anti-REPO antilichamen. Installeer vervolgens de plug-in in ImageJ, opent een stapel confocale beelden en uit te voeren plug-in. Telt gliacellen automatisch in ongeveer 30 seconden. Automatisch tellen van apoptotische cellen. "DeadEasy Caspase larven" plug-in ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Deze werd ontwikkeld om het aantal cellen gelabeld met anti-gekliefde-Caspase3 tellen, en een nieuwe versie werd aangepast voor de larven VNCs. Stekende schade veroorzaakt een toename van geprogrammeerde celdood 11. Voor het gebruik van deze plug-in, first label apoptotische cellen in het monster met behulp van immunofluorescentie met anti-gekloofd-caspase-3 antilichamen. Installeer vervolgens de plug-in in ImageJ, opent een stapel confocale beelden en uit te voeren plug-in. Telt apoptotische cellen automatisch in ongeveer 30 seconden. 8. Reagentia Kweekmedium: Shield en Sang M3 insect medium, 7,5% foetaal runderserum, 1% penicilline en 1% streptomycine. 0,01% Poly-L-lysine in steriele DW. Fixatief: 4% formaldehyde, ultrazuiver in PEM (0,1 M buizen, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO4) oplossing. Blokkerende oplossing voor immunokleuring: 10% normaal geitenserum in 0,3% Triton X PBS. Anti-Glutamine Synthetase2 antilichamen: 1:250 in blokkeeroplossing. Anti-GFP antilichamen 1:1000 in blokkerende oplossing. Anti-REPO antilichamen 1:250 in blokkeeroplossing. Anti-ELAV antilichamen 1:250 in blokkeeroplossing. Anti-gekloofd Caspase 3 antilichamen 1:1000 in blokkerende oplossing. Secundaire antilichamen 1:250 in blokkeeroplossing.