والنموذج الإصابات المعنية بالتحقيق في وسط الجهاز العصبي في إصلاح<em> ذبابة الفاكهة</em
Summary
ويوصف نموذج باستخدام اليرقات إصابة الحبل العصبي البطني ذبابة الفاكهة للتحقيق المركزية تجديد الجهاز العصبي والإصلاح. طعن تليها الليزر المجهر متحد البؤر في الوقت الفاصل بين العينات والثابتة، بالإضافة إلى التحليل الكمي مع البرمجيات المتقدمة هادف وعلم الوراثة، وتستخدم للتحقيق في الآليات الجزيئية للتجديد وإصلاح CNS.
Abstract
وقد تم وضع المنهج التجريبي للتحقيق في الاستجابات الخلوية لنظام العصبي المركزي (CNS) إصابة ذبابة الفاكهة باستخدام الفاكهة ذبابة. إصلاح وتجديد الفهم في الحيوانات هو السؤال الرئيسي في علم الأحياء. الجهاز العصبي المركزي التالفة الإنسان لا تجديد، وفهم كيفية تعزيز التجدد هو واحد من الأهداف الرئيسية لعلم الأعصاب الطبية. ويمكن استخدام مجموعة الأدوات القوية الوراثي للذبابة الفاكهة لمعالجة مشكلة تجديد الجهاز العصبي المركزي.
يتم تطبيق آفة في العصب الحبل البطني CNS (VNC، أي ما يعادل الحبل الشوكي الفقاريات) يدويا باستخدام إبرة التنغستن. يمكن بعد ذلك يتم تصويره في VNC مرور الزمن باستخدام الليزر المجهري متحد البؤر المسح الضوئي لمدة تصل إلى 24 ساعة لمتابعة تطور الآفة مع مرور الوقت. وبدلا من ذلك، يمكن تربيتها عليه، ثم إصلاح وملطخة باستخدام المناعي لتصور الخلايا العصبية والخلايا الدبقية مع المجهري متحد البؤر. استخدام علامات المناسبة، تشايمكن nges في شكل الخلية والخلية الدولة نتيجة الإصابة يمكن تصور. مع يماغيج وضعت عمدا المكونات الإضافية، يمكن أن يتم التحليل الكمي والإحصائي إلى قياس التغيرات في حجم الجرح مع مرور الوقت وآثار إصابة في تكاثر الخلايا وموت الخلايا. تسمح هذه الطرق تحليل عينات كبيرة الحجم. ويمكن الجمع بينها وبين علم الوراثة قوية من ذبابة الفاكهة للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء CNS التجديد والإصلاح.
Introduction
التجديد في الحيوانات تكشف أن خلايا الإحساس عند الكائن الحي وأمرت النمو الكامل، وكيف الهيكلية سلامة الكائن الحي ويتم تحقيق والمحافظة عليها. فهم هذه القدرات غامضة من الخلايا هي ذات أهمية كبيرة في علم الأحياء. تعزيز التجدد هو واحد من الأهداف الرئيسية لعلم الأعصاب الطبية. في البشر، وتلف الجهاز العصبي المركزي (CNS) لا تجديد. وتستخدم نماذج القوارض من إصابة الحبل الشوكي لفهم كيفية استجابة الخلايا للإصابة. ومع ذلك، الشواغل الأخلاقية، والتكاليف العالية ودورة حياة هذه الحيوانات البطيئة للتقيد التقدم.
وذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة هو كائن النموذج المستخدم على نطاق واسع في البيولوجيا التطورية وعلم الأعصاب. بفضل أدواته الوراثية قوية ودورة حياة قصيرة، وأدى ذبابة الفاكهة متكرر لاكتشاف وظائف الجينات والجينات ذات الأهمية الشبكات لفهم البشر والمرض. هناك أدلة وفيرة من يخدع التطوريةservation وظيفة الجين من الذباب للإنسان.
خلال السنوات الأخيرة، تم إنشاء العديد من النماذج لإصابة الجهاز العصبي في ذبابة الفاكهة. بعض تتكون من إتلاف الأعصاب الطرفية التي تعمل على طول الجناح أو axotomy من الأعصاب الطرفية، بما في ذلك 1 الحسية والحركية محاور عصبية 2. ومع ذلك، فإن أنظمة الطرفية والجهاز العصبي المركزي تختلف في كثير من النواحي، وكما هو معروف جيدا أن العديد من الحيوانات في النظام العصبي الطرفي يمكن تجديد في حين أن CNS لا يمكن. وبالتالي، لفهم CNS التجديد، والإصابة المباشرة للCNS هو أكثر ملاءمة. وقد طعن الإصابة بإبرة تطبيقها بنجاح إلى الدماغ الكبار ذبابة الفاكهة للتحقيق في استجابة لإصابة 3،4. باستخدام نهج آخر، وتحليلها عياض وآخرون. CNS قطعت محاور عصبية في أدمغة البالغين مثقف مع السلطة microdissector بيزو، والتجديد لهم لمدة 4 أيام 5. وميزة هذه المجموعة التجريبية ش في وقت لاحقملاحظة هو أنها تركز على الدماغ، والتي هي بلا شك ذات أهمية كبيرة. العيب هو أن الدماغ هو أكثر بكثير تعقيدا من VNC، الذي يتعامل فقط مع المحرك والسيطرة الحسية. العمل على الدماغ الكبار هو أيضا أكثر مضيعة للوقت. اليرقة مستعدة لاجراء تجارب في 4 أيام، في حين يستغرق حوالي 10 يوما لeclosion الكبار، ومن ثم 5 أيام إضافية للنضوج الخاصة بهم. الدماغ الكبار هو أيضا أكثر صعوبة في التعامل معها، لأن ذلك يتم تغليف في إهاب سميكة، والتي من الصعب إزالتها. وVNC لديه الجذب مزيد من كونه وظيفيا إلى الحبل الشوكي الفقاريات.
ويستخدم على نطاق واسع يرقة ذبابة الفاكهة كما كائن نموذج لعلم الأعصاب 6-9. بالمعنى الدقيق للكلمة على الرغم من اليرقة في مرحلة النمو، فإنه يمكن أيضا أن تعتبر الحيوانات تعمل بكامل طاقتها. اليرقة لديها الحركة والحواس متعددة بما في ذلك الذوق، الشم وحس الألم، والتعلم والذاكرة. وهكذا، فإن اليرقات VNC ثكما اختارت النموذج المثالي للإصابة الجهاز العصبي المركزي.
ويمكن تشريح VNCs اليرقات والعذارى ومثقف في الطبق، لا يزال الإبقاء على سلامة الخلوية لمدة تصل إلى 24 ساعة 10. واقترح هذا ويمكن تطبيق ذلك إصابة VNC، والتي يمكن بعد ذلك سجلت في مرور الزمن لأكثر من هذه الفترة من الزمن، أو مستنبت وثابتة في أي لحظة الوقت المطلوب خلال هذه الفترة.
هنا، نقدم لنموذج تجريبي لإصابة الجهاز العصبي المركزي باستخدام اليرقات ذبابة الفاكهة VNC. يتم تشريح أولا VNC من يرقة، ويتم تطبيق إصابة طعن يدويا باستخدام إبرة التنغستن. ثم يتم وضع VNC على ساترة الزجاج القاع، وصورت مع مرور الزمن ليزر متحد البؤر المجهر. وبدلا من ذلك، يمكن للمثقف VNCs لفترة من الوقت المطلوب، ويمكن تحليل آثار الإصابة الخلوية في العينات الثابتة باستخدام المجهر متحد البؤر والمناعية. ويمكن قياس منطقة الجرح، والتحليل الكمي من خلية نويمكن أن يتم mber (تكاثر الخلايا وموت الخلايا) خارجا مع البرمجيات المتقدمة عمدا. ويمكن التعامل مع أحجام عينة كبيرة بسهولة، مما أدى إلى نتائج التحقق من صحة إحصائيا. وقد تم الجمع بين هذه الأساليب بنجاح مع علم الوراثة قوية من ذبابة الفاكهة لاكتشاف الجينات التي تقوم عليها شبكة الاستجابة الدبقية التجدد إلى إصابة الجهاز العصبي المركزي 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
وضعنا بروتوكولا للطعن إصابة في الجهاز العصبي المركزي اليرقات ذبابة الفاكهة للتحقيق في الاستجابات الخلوية لإصلاح والإصابات والتجدد. وتشريح VNCs اليرقات وطعن، وبعد ذلك يتم تصوير أنها مع مرور الزمن المجهري أو المحدد لمضان المناعية لتصور الدبقية والخلايا العصبية، الخلايا أو انقسام الخلايا. ويمكن قياس تطور الآفة مع مرور الوقت. ويرافق هذه الطريقة من قبل البرمجيات المتقدمة عمدا عن التحليل الكمي والإحصائي للتغييرات على عدد الخلايا والإصابة أثناء الإصلاح.
نحن طعن لمدة 96 ساعة AEL اليرقات (وكانت ثابتة إما هذه أو السماح لمواصلة تطوير)، وهي مرحلة التطوير قبل الانتقال إلى خادرة ثم ذبابة الكبار. في 96 ساعة، VNCs هي كبيرة بما يكفي لطعنه، بل هي في منتصف مرحلة الطور الثالث، وبالتالي لا يخضع التشرنق حتى الآن، والجهاز العصبي هو بالفعل مماثلة تماما لتلك التي وظيفية الإعلانULT. قد يكون من الممكن في وقت لاحق قليلا طعن في اليرقات ويجب اختيار توقيت دقيق لتتناسب مع سؤال البحث. ومع ذلك، اعتمادا على الأسئلة الموجهة، سيكون من الضروري عموما ثقافة VNCs لبعض الوقت للاطلاع على الاستجابات الخلوية للإصابة. بعض الوقت بعد 120 ساعة يبدأ التشرنق AEL، وهي فترة عندما CNS هو تشكيلها، وبالتالي الأفضل تجنبها. وبالتالي يقتصر بدلا نافذة الوقت لطعنه الثقافة زائد في اليرقة. باستخدام اليرقات لا يزال لديه ميزة كبيرة على استخدام التقنية البالغين: في حين، على غرار الكبار، والجهاز العصبي هو بالفعل تعمل بكامل طاقتها، وتحليل استجابة لإصابات وأسهل بكثير وأسرع في اليرقات.
عند مقارنة حجم ومورفولوجية العقول وVNCs تشريح ومثقف في طبق لVNCs التي تشريح في وقت لاحق نقطة أي ما يعادل زراعة بدون في طبق، يبدو أن التنمية هي أبطأ في الثقافة مما كانت عليه في الجسم الحي. في جوانب أخرى،التنمية يحمل على عادة في الثقافة، والحفاظ عليها وسلامة الأنسجة والخلايا وتظهر على قيد الحياة ردود متعددة. توسيع الجرح، وإصلاح neuropile وانتشار الدبقية تجري في غضون 22 ساعة بعد طعن. هذا يدل على أن الاستجابات الخلوية لإصابة تحدث في الثقافة، وهناك على الأرجح لا حاجة للحفاظ على إإكسبلنتس لفترة أطول من يوم واحد. إذا كان المطلوب الثقافة على المدى الطويل، قد تتطلب التحسين بروتوكول مزيد من مثل استخدام لوحة إدراج ثقافة 5.
من المهم تحديد عينات نوعية جيدة من تلك التدهور. تحسين هذا البروتوكول يحتاج إلى بعض المهارة وانحطاط لا محالة سوف تحدث في بعض العينات. يمكن للحصول على VNC "القنبيط" المظهر الذي يعكس انهيار سلامة الأنسجة (الشكل 5B). ومن المسلم به أيضا من قبل تنكس تشكل الفجوات من VNC بشكل مستقل عن الطعن، والتي يمكن أن تكون موجودة في العينات غير سليمة طعن، (الشكل 5C </strاونج>). يجب أن يتم تجاهل هذه العينات. وعلى الأرجح سبب انحطاط من تشريح الخام، والتي يمكن أن تمزق الأعصاب وطبقة واقية من الخلايا الدبقية السطح. يجب توخي الحذر الشديد وبالتالي لتشريح بلطف. العوامل المؤثرة الأخرى تشمل ثقافة المتوسط، التي يجب أن تبقى نظيفة ومع المضادات الحيوية، والتقيد الصارم ليغسل وتوقيتات كما هو مبين في البروتوكول. وأخيرا، وطول الإبرة وحامل الإبرة، وحجم الحدة من الإبرة مهمة جدا. يمكن للحامل إبرة تلوث المتوسط الثقافة وإبرة حادة يمكن أن تسبب الإصابة الكبيرة التي لا يمكن إصلاح نفسه، وسوف يؤدي إلى انحطاط. من المهم بشكل روتيني للحفاظ على الإبرة الحادة.
في هذا البروتوكول، ونحن قد استفادت من البروتين خط فخ الذباب لتصور neuropile بالتوازي مع التصور عمليات الدبقية باستخدام التقليدية GAL4-UAS النظام. ويمكن أيضا أن هذه الأدوات جنبا إلى جنب مع غيرها من نظم التعبير الثنائية مثل لوxa موقع 19 و Q-نظام 20، والتي هي مستقلة عن GAL4. وهذا من شأنه تحليل التفاعلات بين محاور عصبية على سبيل المثال والعمليات الدبقية، ردا على الاصابة. من خلال الجمع بين أدوات أخرى مع وراثية أخرى مثل لصحفيين التشعبات 21 أو تدفق الكالسيوم 22، هذا الأسلوب يوفر فرصة كبيرة لتحليل بيولوجيا الخلية وراء استجابة إصابة الخلايا الدبقية، محاور عصبية العصبية والتشعبات في الجهاز العصبي المركزي. وأخيرا، يمكن الجمع بين هذه الطريقة القياسية مع علم الوراثة، والطفرات والإفراط في التعبير عن الجينات، لاختبار وظيفة الجين في الردود على الإصابة والتجدد.
وقد أدى هذا البروتوكول بنجاح إلى اكتشاف شبكة الجينات الكامنة وراء استجابة التجدد الدبقية لإصابة الجهاز العصبي المركزي 11. نظرا لحفظ الجينات التطورية وظيفة، كشف هذه الأحداث الخلوية وظائف الجينات في الذباب الفاكهة من المرجح أن تقدم أفكارا مهمة في فهم أماهCNS mmalian ردا على الإصابات والتجدد.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مي آن ليم لقراءة نقدية للمخطوطة وغيرها من أعضاء مختبرنا لمناقشاتهم طوال هذا العمل. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم يامادا ورويال الزمالات جمعية زيارة قصيرة والاتحاد الأوروبي ماري كوري الدولية GRR زمالة الواردة إلى KK، وBBSRC منحة المشروع (BB/H002278/1) ويلكوم ترست معدات غرانت (073228/Z/03/Z) لAH
Materials
| Equipment | |||
| Staining block | Brunel Microscope | ||
| Forceps No. 5 | e.g. Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
| Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
| Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
| Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
| 35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
| Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
| Reagent | |||
| Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
| FBS | Sigma | F7524 | |
| Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
| Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
| Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
| Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
| Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
| Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
| Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
| Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 |
References
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J. Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. EMBO J. 24, 2944-2955 (2005).
- Kato, K., Awasaki, T., Ito, K. Neuronal programmed cell death induces glial cell division in the adult Drosophila brain. Development. 136, 51-59 (2009).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J. Neurosci. 28, 6010-6021 (2008).
- Rohrbough, J., O’Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila genetic system. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than luck. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 208-215 (2012).
- Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
- Brown, H. L., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-285 (2006).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila protocols. , (2000).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15050-15055 (2001).
- Verkhusha, V. V., et al. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation. J. Biol. Chem. 276, 29621-29624 (2001).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by Pros-Notch and Pros-NFkB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7, 27-41 (1998).
- Forero, M. G., Kato, K., Hidalgo, A. Automatic cell counting in vivo in the larval nervous system of Drosophila. J. Microsc. 46, 202-212 (2012).
- Forero, M. G., Pennack, J. A., Learte, A. R., Hidalgo, A. DeadEasy caspase: automatic counting of apoptotic cells in Drosophila. PLoS One. 4, e5441 (2009).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141, 536-548 (2010).
- Nicolai, L. J., et al. Genetically encoded dendritic marker sheds light on neuronal connectivity in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20553-20558 (2010).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
