Un paradigma de lesión utilizando el cable de Drosophila larval nervio ventral para investigar la regeneración del sistema nervioso central y la reparación es descrito. Stabbing seguido por microscopía confocal de barrido láser en especímenes de lapso de tiempo y fijo, combinada con el análisis cuantitativo con el software desarrollado a propósito y la genética, se utilizan para investigar los mecanismos moleculares de la regeneración del SNC y reparación.
Un método experimental ha sido desarrollado para investigar las respuestas celulares a sistema nervioso central (CNS) lesión utilizando la mosca de la fruta Drosophila. Entendimiento reparación y regeneración de los animales es una cuestión clave en la biología. El SNC humanos dañados no se regenera, y la comprensión de cómo promover la regeneración es una de las metas principales de la medicina neurociencia. El potente conjunto de herramientas genética de Drosophila se puede utilizar para hacer frente al problema de la regeneración del SNC.
Una lesión de la médula nervio del SNC ventral (VNC, equivalente a la médula espinal vertebrado) se aplica manualmente con una aguja de tungsteno. El VNC posteriormente puede ser filmado en intervalos de tiempo mediante microscopía láser confocal de barrido para un máximo de 24 horas para seguir el desarrollo de la lesión con el tiempo. Alternativamente, puede obtenerse un cultivo, después se fijaron y se tiñeron mediante inmunofluorescencia para visualizar las neuronas y las células gliales con microscopía confocal. Usando marcadores apropiados, changes en la morfología celular y estado de la célula como resultado de la lesión puede ser visualizada. Con ImageJ y desarrollado a propósito plug-ins, los análisis cuantitativos y estadísticos pueden llevarse a cabo para medir los cambios en el tamaño de la herida en el tiempo y los efectos de las lesiones en la proliferación celular y la muerte celular. Estos métodos permiten el análisis de muestras de gran tamaño. Se pueden combinar con la genética de Drosophila poderosos para investigar los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración y reparación del SNC.
La regeneración en animales revelan que las células detectan cuando el crecimiento del organismo se ordena y completa, y cómo la integridad estructural de un organismo se logra y se mantiene. La comprensión de estas habilidades misteriosas de las células es de gran interés en la biología. Promover la regeneración es una de las metas principales para el uso médico neurociencia. En los seres humanos, el dañado sistema nervioso central (SNC) no se regenera. Modelos de roedor de lesión de la médula espinal se utilizan para entender cómo las células responden a la lesión. Sin embargo, las preocupaciones éticas, los altos costos y el ciclo de vida de los animales lento limitan el progreso.
La mosca de la fruta Drosophila es un organismo modelo ampliamente utilizado en la biología del desarrollo y la neurociencia. Gracias a sus poderosas herramientas genéticas y ciclo de vida corto, la Drosophila ha recurrentemente llevó al descubrimiento de funciones de genes y redes de genes con relevancia para la comprensión de los seres humanos y la enfermedad. Hay abundante evidencia de la evolución conconservación de la función de genes de las moscas a los humanos.
Durante los últimos años, varios paradigmas de lesiones del sistema nervioso han sido establecidas en Drosophila. Algunos consisten en daños en los nervios periféricos que se ejecutan a lo largo del ala o axotomía de los nervios periféricos, incluyendo sensorial y motor axones 1 2. Sin embargo, los sistemas nerviosos periférico y central difieren en muchos aspectos, y es bien sabido que en muchos animales del sistema nervioso periférico pueden regenerarse mientras que el SNC no puede. Por lo tanto, para entender la regeneración del SNC, daño directo al sistema nervioso central es más apropiado. Daño punzante con una aguja ha sido aplicado con éxito al cerebro adulto Drosophila para investigar la respuesta a la lesión 3,4. Con otro enfoque, Ayaz et al. Cercenadas axones del sistema nervioso central en los cerebros adultos cultivadas con microdissector Piezo poder, y analizaron su regeneración durante 4 días 5. La ventaja de estos u grupo experimental despuésps es que se centran en el cerebro, que es sin duda de gran interés. La desventaja es que el cerebro es mucho más complejo que el VNC, que trata sólo con el motor y el control sensorial. Trabajo en el cerebro adulto es también más tiempo. La larva está listo para experimentos en 4 días, mientras que se tarda unos 10 días para la eclosión de adultos, y luego otros 5 días para su maduración. El cerebro adulto es también más difícil de manejar, ya que está encapsulado en cutícula gruesa, que es difícil de quitar. El VNC tiene la atracción adicional de ser funcionalmente equivalente a la médula espinal de vertebrados.
La larva de Drosophila se utiliza ampliamente como un organismo modelo para la neurociencia 6-9. Aunque en sentido estricto la larva se encuentra en una fase de desarrollo, sino que también puede ser considerado un animal completamente funcional. La larva tiene locomoción, múltiples sentidos, incluyendo el olfato, el gusto y la nocicepción y el aprendizaje y la memoria. Por lo tanto, la larva VNC wcomo escogido como el modelo ideal para la lesión del SNC.
VNCs mortalidad de las larvas puede ser diseccionado y se cultivaron en una placa, que conserva la integridad celular durante un máximo de 24 horas 10. Esto sugiere que la lesión podría ser aplicado a la VNC, que entonces podrían ser registrados en intervalos de tiempo para durante este período de tiempo, o se cultivan y se fija en cualquier punto de tiempo deseado dentro de este período.
A continuación, presentamos un paradigma experimental de lesión del SNC utilizando la Drosophila larval VNC. El VNC es primero disecados de la larva y la lesión punzante se aplica manualmente con una aguja de tungsteno. El VNC se coloca entonces sobre un cubreobjetos de vidrio de fondo, y filmada con láser de lapso de tiempo microscopía confocal de barrido. Alternativamente, los VNCs pueden cultivarse durante un período de tiempo deseado, y los efectos celulares de la lesión pueden ser analizados en las muestras fijadas mediante inmunotinción y microscopía confocal. El área de la herida puede ser medida, y el análisis cuantitativo de células numbre (proliferación celular y la muerte celular) puede llevarse a cabo con el software desarrollado a propósito. Muestras de gran tamaño se pueden manejar fácilmente, resultando en resultados estadísticamente validados. Estos métodos se han combinado con éxito con la genética de Drosophila poderosas para descubrir una red de genes subyacentes de la respuesta glial regenerativa a una lesión del SNC 11.
Hemos establecido un protocolo para apuñalar lesión en el SNC de Drosophila de larvas para investigar las respuestas celulares a las lesiones, la reparación y la regeneración. VNCs larvas se diseccionaron y apuñalado, tras lo cual se filmó con microscopía de time-lapse o fijada para la inmunotinción de fluorescencia para visualizar la glía y neuronas, la apoptosis o la división celular. La progresión de la lesión con el tiempo se puede medir. Este método está acompañado por el software desarrollado a propósito para el análisis cuantitativo y estadístico de los cambios en el número de células después de la lesión y durante la reparación.
Nos apuñaló 96 horas larvas AEL (y estos se fijaron bien o permitido desarrollar otra forma), una etapa de desarrollo antes de la transición a pupa y luego mosca adulta. A las 96 h, VNCs son lo suficientemente grandes para punzante, que están en el medio de tercera etapa instar, y por lo tanto no están sometidos a la pupación todavía, y el sistema nervioso ya es totalmente funcional similar a la de la adULT. Podría ser posible para apuñalar a un poco más tarde en las larvas y el momento preciso debe ser elegido para satisfacer la pregunta de investigación. Sin embargo, en función de las preguntas planteadas, generalmente será necesario cultivar los VNCs durante algún tiempo para observar las respuestas celulares a la lesión. Algún tiempo después de 120 aperturas pupación hr AEL, un período en el SNC es remodelado y por lo tanto es mejor evitar. Así, la ventana de tiempo para apuñalar a la cultura más en la larva es bastante restringido. Uso de las larvas aún tiene una gran ventaja técnica sobre el uso de los adultos: mientras que, de manera similar a la de adultos, el sistema nervioso es ya completamente funcional, el análisis de la respuesta a la lesión es considerablemente más fácil y más rápido en las larvas.
Al comparar el tamaño y la morfología de los cerebros y VNCs disecados y se cultivaron en una placa a VNCs que se hayan diseccionado en un punto de tiempo equivalente más tarde sin cultivar en un plato, parece que el desarrollo es más lento en su cultivo que in vivo. En otros aspectos,desarrollo lleva a cabo normalmente en la cultura, la integridad del tejido se conserva y las células están vivas mostrando múltiples respuestas. Expansión de heridas, la reparación y la proliferación glial neuropile tener lugar dentro de 22 horas después de la puñalada. Esto muestra que las respuestas celulares a lesiones tienen lugar en la cultura y hay más probabilidades hay necesidad de mantener los explantes durante más de un día. Si la cultura a largo plazo se desea, el protocolo puede requerir una mayor optimización, tales como el uso de un inserto de placa de cultivo 5.
Es importante para identificar las muestras de buena calidad de los degeneración. Optimización de este protocolo tiene cierta habilidad y degeneración inevitablemente se producirá en algunos ejemplares. El VNC puede adquirir un 'coliflor' apariencia que refleja una ruptura de la integridad del tejido (Figura 5B). Degeneración también es reconocido por la vacuolización de la VNC independientemente del apuñalamiento, que puede estar presente en intacta, no apuñalados muestras (Figura 5C </strong>). Estas muestras deben ser desechados. La degeneración es muy probablemente causado por la disección áspera, que puede romper los nervios y la capa protectora de las células de la superficie. Así, la atención se debe tener mucho para diseccionar con cuidado. Otros factores que influyen son el medio de cultivo, que debe mantenerse limpio y con antibióticos, apegándose estrictamente a los lavados y los horarios indicados en el protocolo. Por último, la longitud del soporte de la aguja y la aguja, el tamaño y la nitidez de la aguja son muy importantes. El soporte de aguja puede contaminar el medio de cultivo y una aguja roma puede causar un daño grande que no puede repararse a sí mismo y conducir a la degeneración. Es importante mantener rutinariamente la aguja afilada.
En este protocolo, que se aprovechó de una línea de trampas de moscas de la proteína para visualizar el neuropile en paralelo a la visualización de los procesos gliales utilizando el tradicional GAL4-UAS sistema. Estas herramientas también se podría combinar con otros sistemas binarios de expresión tales como la LexA 19 y Q-sistema 20, que son independientes de GAL4. Esto permitiría el análisis de las interacciones, por ejemplo entre los axones y procesos gliales, en respuesta a una lesión. Por más que la combinación con otras herramientas genéticas como reporteros de dendritas 21 o la entrada de calcio 22, este método proporciona una gran oportunidad para analizar la biología de las células detrás de la respuesta lesión de las células gliales, axones y dendritas neuronales en el sistema nervioso central. Finalmente, este método se puede combinar con la genética estándar, las mutaciones y la sobre expresión de genes, para probar la función de genes en respuesta a una lesión y regeneración.
Este protocolo ha dirigido con éxito para el descubrimiento de un gen de red subyacente en la respuesta regenerativa glial a la lesión del SNC 11. En vista de la conservación evolutiva de la función de genes, desentrañando los eventos celulares y las funciones de genes en moscas de la fruta puede proporcionar importantes conocimientos sobre la comprensión de la maCNS mmalian respuesta a la lesión y regeneración.
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a Mei Ann Lim para la lectura crítica del manuscrito y otros miembros de nuestro laboratorio para sus debates a lo largo del curso de este trabajo. Este trabajo fue financiado por la Fundación Científica Yamada y Royal Society Becas corta visita y la Unión Europea Marie Curie Fellowship GRR Internacional Entrante a KK, y BBSRC Proyecto Grant (BB/H002278/1) y Wellcome Trust Equipo Grant (073228/Z/03/Z) a AH
Equipment | |||
Staining block | Brunel Microscope | ||
Forceps No. 5 | e.g. Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
Reagent | |||
Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
FBS | Sigma | F7524 | |
Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 |