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Neuroscience

Un paradigma Infortunio per Indagare riparazione del sistema nervoso centrale in<em> Drosophila</em

Published: March 28, 2013
doi:
10.3791/50306
,
1Neurodevelopment Group, School of Biosciences,University of Birmingham

Summary

Un paradigma danno usando il cavo larvale nervoso ventrale Drosophila per studiare la rigenerazione del sistema nervoso centrale e la riparazione è descritto. Stabbing seguito da scansione laser microscopia confocale in time-lapse e fissi campioni, combinata con l'analisi quantitativa con software volutamente sviluppato e genetica, sono utilizzati per studiare i meccanismi molecolari della rigenerazione e riparazione del SNC.

Abstract

Un metodo sperimentale è stato sviluppato per studiare le risposte cellulari al sistema nervoso centrale (SNC) infortunio con il moscerino della frutta Drosophila. Comprensione riparazione e la rigenerazione negli animali è una questione fondamentale in biologia. La CNS danneggiati umani non si rigenera, e capire come promuovere la rigenerazione è uno degli obiettivi principali del medico neuroscienze. Il toolkit potente genetica della Drosophila può essere utilizzato per affrontare il problema della rigenerazione del SNC.

Una lesione al cordone nervoso ventrale CNS (VNC, equivalente al midollo spinale vertebrato) viene applicato manualmente con un ago di tungsteno. Il VNC può essere successivamente girato in time-lapse utilizzando la scansione microscopia confocale laser per un massimo di 24 ore per seguire lo sviluppo della lesione nel tempo. In alternativa, può essere coltivato, poi fissate e colorate con immunofluorescenza per visualizzare neuroni e cellule gliali con microscopia confocale. L'uso dei marcatori appropriati, chaNGES della morfologia cellulare e stato della cellula come risultato di lesioni può essere visualizzato. Con ImageJ e appositamente sviluppato plug-in, analisi quantitative e statistiche possono essere effettuati per misurare le variazioni di dimensione della ferita nel tempo e gli effetti di lesioni nella proliferazione cellulare e morte cellulare. Questi metodi consentono l'analisi di campioni di grandi dimensioni. Possono essere combinati con la genetica potenti di Drosophila per indagare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione del SNC e la riparazione.

Introduction

Rigenerazione in animali rivela che le cellule percepire quando la crescita dell'organismo è ordinato e completo, e in che modo l'integrità strutturale di un organismo è raggiunto e mantenuto. La comprensione di queste misteriose capacità di cellule è di grande interesse per la biologia. Promuovere la rigenerazione è uno degli obiettivi chiave per medico neuroscienze. Negli esseri umani, il danneggiato sistema nervoso centrale (CNS) non rigenera. Modelli di roditori di lesioni del midollo spinale sono utilizzati per comprendere come le cellule rispondono al danno. Tuttavia, le questioni etiche, i costi elevati e il ciclo di vita degli animali lenta limitano il progresso.

Il moscerino della frutta Drosophila è un organismo modello molto utilizzato in biologia dello sviluppo e delle neuroscienze. Grazie ai suoi potenti strumenti genetici e ciclo di vita breve, Drosophila ha ripetutamente portato alla scoperta delle funzioni dei geni e delle reti di geni con rilevanza per la comprensione degli esseri umani e le malattie. Ci sono prove abbondanti di con evolutivaconservazione della funzione del gene dalle mosche per l'uomo.

Negli ultimi anni, diversi paradigmi per le lesioni del sistema nervoso sono stati stabiliti in Drosophila. Alcuni sono costituiti da danneggiare nervi periferici che corrono lungo l'ala o assotomia dei nervi periferici, di cui 1 sensoriali e motori assoni 2. Tuttavia, i sistemi nervoso centrale e periferico differiscono per molti aspetti, ed è ben noto che in molti animali il sistema nervoso periferico che può rigenerare il CNS non può. Così, per capire la rigenerazione del SNC, danno diretto al sistema nervoso centrale è più appropriato. Lesioni accoltellato con un ago è stato applicato con successo al cervello adulto Drosophila per studiare la risposta al danno 3,4. Utilizzando un metodo diverso, Ayaz et al. Assoni del sistema nervoso centrale mozzate nel cervello adulto in coltura con una potenza piezo microdissector, e analizzato la loro rigenerazione per 4 giorni 5. Il vantaggio di questi u set dopo sperimentaleps è che si concentrano sul cervello, che è senza dubbio di grande interesse. Lo svantaggio è che il cervello è molto più complesso rispetto al VNC, che si occupa solo di motore e di controllo sensoriale. Lavorare sul cervello adulto è anche più tempo. La larva è pronto per esperimenti in 4 giorni, mentre ci vogliono circa 10 giorni per eclosion adulti, e poi altri 5 giorni per la loro maturazione. Il cervello adulto è anche più difficile da gestire, perché è incapsulato in spessa cuticola, che è difficile da rimuovere. Il VNC ha l'attrazione ulteriore di essere funzionalmente equivalente al midollo spinale vertebrato.

La larva di Drosophila è ampiamente utilizzato come organismo modello per le neuroscienze 6-9. Sebbene strettamente parlando la larva è in una fase di sviluppo, può anche essere considerato un animale completamente funzionale. La larva ha locomozione, dei sensi multiple, tra cui l'olfatto, il gusto e nocicezione, e l'apprendimento e la memoria. Così, il larvale VNC wa scelta come il modello ideale per le lesioni del SNC.

VNCs larvali e di pupa può essere sezionato e coltivate in piatto, mantenendo l'integrità cellulare per un massimo di 24 ore 10. Questo suggerisce che il pregiudizio potrebbe essere applicato al VNC, che potrebbe quindi essere registrate in time-lapse per questo periodo di tempo, o coltivati ​​e fissato in qualsiasi punto di tempo desiderato entro questo periodo.

Qui, presentiamo un paradigma sperimentale per le lesioni del SNC utilizzando la Drosophila larvale VNC. Il VNC viene prima sezionato dalla larva, e lesioni lancinante si applica manualmente con un ago di tungsteno. Il VNC è poi posto su un fondo di vetro coprioggetto, e girato con time-lapse microscopia confocale a scansione laser. In alternativa, i VNCs possono essere coltivate per un periodo di tempo desiderato, e gli effetti cellulari di lesioni possono essere analizzati in campioni fissati mediante immunocolorazione e microscopia confocale. L'area della ferita può essere misurata, e l'analisi quantitativa di cellule number (proliferazione cellulare e morte cellulare) può essere effettuata con il software appositamente sviluppato. Dimensioni del campione di grandi dimensioni possono essere facilmente gestiti, con conseguente risultati statisticamente convalidati. Questi metodi sono stati con successo in combinazione con la genetica potenti di Drosophila per scoprire una rete gene alla base della risposta gliale rigenerativa a lesioni del SNC 11.

Protocol

1. Raccolta di Staged larve Place 15 femmine e 15 maschi adulti mosche in una gabbia cilindrica perspex per deporre le uova su una piastra di Petri con agar e succo d'uva integrato con una piccola paletta di lievito in pasta per 3 ore a 25 ° C. Modificare la piastra 3-4 volte al giorno, e scartare la prima piastra (cioè da O / N uovo-laico). Eliminare anche le piastre dal primo giorno. Dal secondo giorno in poi, mantenere le piastre con le uova a 25 ° C. Dopo 7 giorni di raccolta di uova, iniziare con una nuova messa a punto di mosche padre. Dopo circa 24 ore, larve si schiudono dalle uova. Agganciando larve con un pennello o diluito con un paio di pinze, trasferire 35 larve dalla agar uve ad un flacone contenente cibo standard fly (10 ml) (Figura 1A). Mantenere le fiale contenenti larve per 3 giorni (96 ore dopo la posa Egg, AEL) a 25 ° C. 2. Dissezione di larvali cordoni nervosi ventrali per la cultura Pulire esserench e le mani con il 70% di etanolo. Mettere a bagno 4 blocchi di colorazione, 2 paia di pinze e un ago con il 70% di etanolo, e lasciare asciugare all'aria. Preparare 4 blocchi di colorazione i seguenti supporti: uno con acqua distillata (DW) per la pulizia e per le larve piscina pulita, un secondo con 2 ml di Shield e Sang medie M3 insetto con 1% di penicillina e streptomicina, ecdisone-free (M3 PS media) per sezionare le larve, un terzo con 2 ml di terreno M3 PS piscina sezionati cordoni nervosi ventrali (VNCs), ed un quarto con 2 ml di terreno M3 PS per pugnalare i VNCs. Tutti i reagenti devono essere pre-riscaldato a temperatura ambiente. Aggiungere acqua nel flacone contenente 96 ore larve AEL. Quindi, utilizzando una spatola, delicatamente diffuso alimentare con larve dal flacone su un tovagliolo di carta bagnata. Trasferire 10 larve di un blocco contenente colorazione DW per lavare via il cibo. Sostituire DW 6 volte. Quindi sostituire con mezzo M3 PS. Trasferire una delle larve di un blocco colorazione contenente 2 ml di terreno M3 PS. Sotto un microscopio per dissezione, dissect un cervello larvale accuratamente utilizzando metodi standard 12, ma per ridurre al minimo i danni ai tessuti, particolare cura procedendo nel modo seguente. Posizionare il lato dorsale larva, e tenere premuto il lato dorsale a un terzo dalla fine anteriore con 2 coppie di pinze (una in ogni mano). Pur tenendo la parte anteriore, tirare via l'estremità posteriore con le pinze, e strappare l'epidermide. Il cervello e il VNC deve essere visibile dal bordo posteriore della metà anteriore. Attenzione isolare il cervello e complesso VNC rimuovendo il grasso corporeo, l'intestino e l'epidermide. Quando i VNCs sono danneggiati troppo, i VNCs degenererà in tutto o in parte, anche senza lesioni accoltellamento. Prendere in considerazione i seguenti punti: Non tirare o strappare i dischi immaginali e dei nervi periferici del torace VNC per non danneggiare il VNC. Per tagliare i nervi periferici, tenere i nervi periferici con due coppie di pinze poste vicino l'un l'altro, e poi tirare i nervi con la perporcini. Dischi immaginale e parti della bocca possono essere lasciati attaccati al VNC. Lasciare la ghiandola anello e ghiandola linfatica collegato al cervello. Tagliare il budello nel punto più vicino al cervello, dove è contenuto il cibo non molto. Utilizzando un P20 Pipetman con la punta tagliata e allargato un po ', trasferire il VNC ad un blocco contenente colorazione fresca M3 media PS. Prima di trasferire l', VNC prima pipetta su e giù solo il mezzo utilizzato per la dissezione, per evitare l'VNC di attaccarsi alla punta. 3. Stabbing Infortunio alla larvale Drosophila VNC Questa sezione descrive come eseguire lesioni pugnalare alle VNCs, e di preparare accoltellati-VNCs per time-lapse di analisi e immunostaining. Post-lancinanti condizioni di coltura e la durata sono descritte nella sezione 5 (per time-lapse analisi) e nella sezione 6 (per immunostaining). Dopo la messa in comune VNCs abbastanza (4-5 per time-lapsee più di 24 per immunostaining), trasferisce un VNC ad un blocco colorazione pulita contenente M3 PS. Orientare il VNC in modo che il neuropile dorsale è tenuto sotto il microscopio da dissezione (Figura 1B). Questo è l'orientamento più naturale per VNCs a mentire se collegato ai lobi ottici. Stab manualmente usando un ago di tungsteno sotto il microscopio dissezione, dal lato dorsale pressoché ad angolo retto e puntando il mezzo addominale del VNC (Figura 1B). Prestare particolare attenzione per quanto segue: Stab sola volta. Stab finché l'ago urta il fondo del bicchiere. Tuttavia, fare attenzione a non danneggiare la punta dell'ago. Lo stelo del supporto dell'ago non deve toccare il terreno durante la lancinante. La ferita non è visibile al microscopio dissezione. Nota: Stab-infortunio degenerazione indipendente La procedurapuò portare a degenerazione cellulare nel VNC distinto dalla lesione coltellate. Risultati degenerazione buchi nel neuropile, e, occasionalmente, i fori sono stati osservati nella corteccia di esemplari non accoltellati. I campioni con degenerazione colpisce la degenerazione neuropile o diffusa che colpisce anche la superficie VNC deve essere scartato. Degenerazione possono essere identificati come segue: Superficie ruvida, specialmente al laterale / zona ventrale del torace, a 22 ore di coltellate. In casi estremi, il VNC sembra sporgente. Fori o vacuoli nel neuropile toracica, che può essere visibile come fori segnale di fondo con immunocolorazione fluorescenza. 4. Manutenzione di Ago e Pinze Controllare periodicamente se la punta dell'ago è abbastanza affilato. La punta dell'ago può essere piegato o spuntato dopo averlo usato per diversi esperimenti. In questo caso, affilare la punta con una pietra Arkansas o equivalente. Le punte della pinza devonoincontrano perfettamente. Le punte possono essere danneggiati con l'uso. In questo caso, regolare la punta con un pietre Arkansas o equivalente. 5. Cultura e registrazione time-lapse di VNCs accoltellato Per visualizzare il neuropile assonale nel VNC vivente, una linea di proteina GFP trappola che etichetta tutti gli assoni – G9 13 – possono essere utilizzati, e di visualizzare tutte le cellule gliali (tranne la glia linea mediana) il driver gliale repoGAL4 può essere utilizzato per esprimere il UASdsRed S197Y 14 reporter. Attraversando G9 vola UASdsRedS197Y;, repoGAL4 mosche, VNCs da larve progenie si ottengono con assoni e glia verde rosso che possono essere registrate nei tessuti viventi. Dopo pooling VNCs 4-5, trasferire 1 VNC ad un blocco colorazione pulito contenente 2 ml di M3 PS, e colpire la parte addominale del VNC, come indicato nella sezione 3. Trasferire il accoltellato VNC ad una poli-L-lisina rivestito 3,5 mm di vetro piatto fondo Petri contenente 1 ml di M3PS. Posizionare il lato VNCs dorsale verso il basso. Spingere delicatamente il VNC con la parte piatta di un paio di pinze per consentire al VNC di aderire al piatto. Delicatamente aggiungere 1 ml di M3 PS 15% FBS rendere la concentrazione finale di 7,5% di FBS. Acquisire immagini con scansione laser microscopia confocale. Eseguire la scansione del VNC, la raccolta di una Z-sezione della serie in tutto lo spessore. Abbiamo usato un microscopio invertito Leica SP2 confocale con una camera a temperatura controllata ambientale. Ogni microscopio confocale equivalente dovrebbe funzionare, ma può richiedere l'ottimizzazione delle impostazioni per la scansione. Le impostazioni per il nostro tempo-lapse microscopia confocale sono stati i seguenti: temperatura della camera ambientale: 25 ° C; 20X obiettivo con zoom 4 volte; modalità di scansione xyzt, con risoluzione 512×512 pixel, z = passi di 1 micron e di 1 ora o 2 – intervalli di un'ora. Il microscopio confocale Leica SP2 ha un limite di dimensione del file per la scansione. Con queste impostazioni, 8-9 tempi di valutazione può essere acquisita. Conaltri microscopi confocale, dovrebbe essere possibile acquisire serie di immagini per i punti di tempo più lunghi, vale a dire nell'arco di un massimo di 24 ore. 6. Cultura e immunocolorazione di VNCs accoltellato e fisso Preparare un 24 pozzetti piastra di coltura tissutale contenente 500 ml di M3 PS 7,5% FBS per pozzetto. Ripetere la dissezione di più di 24 VNCs per un piatto di 24 pozzetti di coltura. Usando il P20 Pipetman con la punta cut-off, di trasferimento 12 VNCs non pugnalato dalla piscina al piatto di coltura, utilizzando 1 VNC per pozzetto. Stab il resto VNCs in piscina, come descritto nella sezione 3. Trasferire ogni accoltellato VNC per un pozzo ciascuno. Posizionare il piatto a 24 pozzetti in incubatore a 25 ° C per una durata desiderata a seconda dell'esperimento. Integrità cellulare è inalterato per almeno 24 ore. Dopo la cultura, trasferire i 12 VNCs in 250 microlitri della PEM formaldeide al 4% in una provetta 1,5 ml utilizzando il P20 Pipetman con la punta cut-off. Poi, il fixative è attentamente pipettato fuori, facendo attenzione a non danneggiare le VNCs. Una piccola quantità di fissativo sufficiente a coprire i campioni dovrebbero rimanere in ogni provetta. Successivamente, aggiungere fissativo fresco, e agitare delicatamente per 50 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare due volte con 0,3% Triton X PBS, e quindi lavare due volte per 10 minuti con 0,3% Triton X PBS a RT. VNCs blocco di incubazione con 10% siero di capra normale in 0,3% Triton X PBS per 1 ora a RT. I campioni possono essere conservati a 4 ° C per almeno un mese. Incubare VNCs con anticorpi primari per più di 20 ore a 4 ° C. Risciacquare due volte con 0,3% Triton X PBS, poi lavare 3 volte per 10 minuti con 0,3% Triton X PBS a RT. Incubare VNCs con anticorpi secondari per più di 16 ore a 4 ° C. Lavare 2 volte con 0.3% Triton X PBS, poi lavare 3 volte per 10 min con 0.3% Triton X PBS a temperatura ambiente RT (al buio se si utilizza anticorpi secondari fluorescenti). Sostituire PBS con glicerolo al 50%: 50% PBS per almeno unore. Quindi sostituire con glicerolo 80%: 20% PBS per almeno un'ora. Montare un VNC in una finestra realizzata su 2 strati di violoncello-tape (circa 0,06 mm) su una lastra di vetro microscopio. Regolare l'orientamento, e mettere un coprioggetto (18×18 mm) sopra la finestra. Due VNCs può essere montato su una slitta con questo metodo. Utilizzando una varietà di anticorpi primari, diverse risposte cellulari al danno può essere analizzato (ad esempio modifiche del numero di cellulare e la forma delle cellule). 7. Analizzare i dati utilizzando ImageJ e una serie di Plugin Se il VNC non ha accoltellato degenerazione indipendenti, il campione deve essere calcolato in per l'analisi a prescindere dalle dimensioni della lesione. Come lancinante avviene manualmente, la dimensione della lesione varia ogni volta. Quindi è importante analizzare statisticamente l'effetto di coltellate, quando possibile. Ferita misura delle dimensioni. La dimensione della ferita è un indicatore di riparazione 15.La lesione accoltellamento è visibile in quanto priva di espressione GFP. Zona della lesione può essere misurato utilizzando dati lapse disponibile gratuitamente il software ImageJ, come segue: Utilizzando ImageJ, aprire una pila di immagini confocali dal menu "File", selezionare "Importa" e da qui selezionare "sequenza di immagini". Questo accende la raccolta di singole immagini in una pila. Avanti cambiare la "pila" in un "HyperStack" andando al menu "Image", selezionare "HyperStack", quindi selezionare "Pila a HyperStack". Impostare la dimensione voxel utilizzando "Proprietà" dal menu "Immagine". In dati acquisiti utilizzando il microscopio confocale Leica SP2, la dimensione voxel può essere ottenuta dalla scansione-software, e dal file di testo metadati salvati insieme alle immagini. Con la nostra impostazione come descritto nella Sezione 3, le dimensioni in pixel sono xy = 0,366211 micron e z = 0,99709 micron. Esaminando tutte le fette in un punto di tempo, disegnare il contorno della zona di massima lesione con il poligono strumento di selezione nella barra degli strumenti. Questo è l'Regione di interesse (ROI). Aggiungere il ROI al gestore ROI andando al menu "Analizza", scorrere verso il basso e selezionare "Strumenti", quindi "manager ROI", poi "add". Ripetere questa procedura per i tutti i punti temporali. Fare clic sul pulsante "Misura" nel gestore di ROI per ottenere la dimensione area di ogni ROI. Correzione del movimento VNC durante registrazioni time-lapse. "Stackreg" e "Turboreg" plugin 16 (dal sito ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ): questi plugin permettono di correggere movimenti campioni di piccole durante il time-lapse. Costruire una pila con un equivalente sezione rappresentativa ottica attraverso tutti i punti temporali e applicare i plug-in. Essa aiuta a visualizzare come cambia lesione nel tempo. I dettagli su questi metodi e il manuale di istruzioni sono disponibili presso il gruppo di ricerca che ha sviluppato questi plugin. ( http://bigwww.epfl.ch / Thevenaz / stackreg /). Conteggio automatico di cellule gliali. "DeadEasy glia" plugin ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ): questo è stato progettato per contare il numero di cellule gliali REPO-positivi nel larvale Drosophila VNC e di esaminare la variazione gliale numero di coltellate causati da lesioni 17. Il plug-in funziona con precisione, con un errore di 0,1% di falsi positivi e falsi negativi 4,3% 17. Per utilizzare questo plug-in, prima etichetta tutta la glia (tranne la linea mediana) nel campione mediante immunofluorescenza con anticorpi anti-REPO. Quindi installare il plug-in in ImageJ, aprire una pila di immagini confocale ed eseguire plug-in. Conta cellule gliali automaticamente in circa 30 secondi. Conteggio automatico di cellule apoptotiche. "Larve caspasi DeadEasy" plug-in ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Questo è stato sviluppato per contare il numero di cellule marcate con anti-spaccati-Caspase3, e una nuova versione è stata adattata per i VNCs larvali. Lancinante lesione provoca un aumento della morte cellulare programmata 11. Per utilizzare questo plug-in, le cellule apoptotiche prima etichetta del campione con immunofluorescenza con anti-spaccati-caspasi-3 anticorpi. Quindi installare il plug-in in ImageJ, aprire una pila di immagini confocale ed eseguire plug-in. Conta cellule apoptotiche automaticamente in circa 30 secondi. 8. Reagenti Cultura media: Shield e Sang medie insetti M3, 7,5% di siero fetale bovino, 1% e l'1% penicillina streptomicina. 0,01% Poly-L-lisina in sterile DW. Fissativo: 4% di formaldeide, ultra pura PEM (0.1 TUBI M, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO4) soluzione. Soluzione bloccante per immunostaining: 10% di siero di capra normale in 0,3% Triton X PBS. Anti-glutammina sintetasi2 anticorpi: 1:250 in soluzione di blocco. Anti-GFP anticorpi: 1/1.000 a bloccare soluzione. Anticorpi anti-REPO: 1:250 in soluzione di blocco. Anti-ELAV anticorpi: 1:250 in soluzione di blocco. Anti-spaccati caspasi 3 anticorpi: 1/1.000 a bloccare soluzione. Anticorpi secondari: 1:250 in soluzione di blocco.

Representative Results

Qui vi mostriamo come eseguire lesioni pugnalata al larvale Drosophila VNC e analizzare le risposte cellulari al danno con time-lapse e immunostaining microscopia confocale a fluorescenza. Per time-lapse dati, la lesione è visualizzato come una GFP-negativo area all'interno della neuropile di esemplari recanti il marcatore assonale G9 (Figura 2). Poco dopo accoltellamento, piccole aree GFP-negativi, che sembrano buchi o vacuoli, cominciano ad apparire (Figura 2A). Tale GFP-negativi aree generalmente ingrandire fino a circa 6-8 ore dopo accoltellamento (Figura 2A). Successivamente, le GFP-negativi aree restringono e può anche scomparire (Figura 2B). Da 22 ore dopo accoltellamento, l'area occupata dalla ferita è generalmente inferiore alla superficie massima era a 6 a 8 ore dopo accoltellamento (figure 2A, B). Analogamente il DsRed-negativo zona processi gliali aumenta inizialmente troppo, ma Shirinks da 22 ore dopo l'accoltellamento. Curiosamente, spesso processi gliali DsRed-positivi riempire le GFP-negativi fori nel neuropile prima della loro scomparsa (Figura 2C). Utilizzo immunocolorazione in campioni fissati, belle processi gliali e la loro risposta a lesioni possono essere visualizzati con una risoluzione migliore che con time-lapse immagini. Questo può essere fatto, per esempio, utilizzando il conducente repoGAL4 gliale di indurre l'espressione di un reporter membrana tethered (es UAS-mCD8GFP) in linea di visualizzare tutte le cellule gliali (tranne la glia linea mediana). Questo può anche essere combinato con altri marcatori gliali, come anti-GS2, che etichetta cellule gliali neuropile-associati (figure 3A, B). Qui si dimostra che anche se il cordone nervoso ventrale viene pugnalato dal lato dorsale, lancinante risultati pregiudizio in un dente ventrale (figura 3a, punte di freccia). Stabbing sembra interessare più severamente l'neuropile e neuropile-esima associata cellule glialiuna superficie corteccia e cellule gliali (Figura 3B). Processi gliali appaiono disorganizzati nel neuropile, mentre continuano a mantenere la loro rete come l'organizzazione della corteccia. Risultati infortuni in GS2-positivo detriti cellulari, che si distingue da cellule normali come frammenti di detriti sono molto più piccoli e non collegato ad un corpo cellulare. Questo rivela danni alle cellule gliali neuropile-associati (Figura 3B). Degenerando neuropile associate cellule gliali sono state osservate anche al microscopio elettronico 15. Anti-spaccati-Caspasi 3 apoptosi + colorazione si osserva nelle cellule gliali neuropile-associati 15, dimostrando di apoptosi su accoltellamento lesioni. Neuropile cellule gliali sono stati associati anche dimostrato di fagocitare i detriti neuronale 15, e GS2 + segnale potrebbe anche rivelare l'immersione dei neuroni apoptotici da processi gliali. Spaccati-caspasi + cellule apoptotiche sono anche osservati nella corteccia, almeno alcuni dei quali corrispondono a Elav + neuroni ( <strong> Figura 3C). Utilizzando campioni fissi e immunocolorazione permette anche analisi quantitative delle risposte cellulari al danno, come ad esempio gli effetti di proliferazione e apoptosi. Per questo, abbiamo volutamente sviluppato due ImageJ plug-in, Larva Caspase DeadEasy e glia DeadEasy, a contare automaticamente il numero di cellule gliali e cellule apoptotiche, rispettivamente. Essi sono stati convalidati per lavorare su VNCs larvali e sono molto precisi. Usando questi, è possibile osservare un aumento del numero di cellule gliali REPO-positivi causati da lesioni lancinante, da 22 ore (Figura 4A) 15. Vi è anche un aumento del numero di cellule apoptotiche anti-spaccati-caspasi-3 da 6 ore post-stabbing (Figura 4B) 15. Tale aumento nella proliferazione gliale e apoptosi in risposta al danno del SNC Drosophila ricorda la risposta lesione nel SNC vertebrati. Un aspetto cruciale di questa proprotocollo è la qualità del dissezioni VNC. È difficile dire al momento della dissezione se le VNCs sono stati danneggiati o non nel processo. E 'importante prestare particolare attenzione per eseguire dissezioni dolci. Tuttavia, i campioni di cattiva qualità sarà inevitabilmente prodotta, ed è essenziale che questi sono identificati in fasi successive e scartato. Nelle nostre mani, la degenerazione VNC apparentemente non correlato al danno, ma causata da dissezione ruvida. Non abbiamo osservato una dimensione critica nella ferita ferite, e analizziamo tutti i campioni infortunati che non sono degradati. Quando VNCs mantenere la loro integrità, la superficie VNC tende a guardare liscia e lucida, e senza fori nel neuropile si osservano (Figura 5A). Degradazione di VNCs può essere riconosciuto da 24 hr post-dissezione dalla superficie ruvida delle zone VNC ventrali e laterali (Figura 5B). La degradazione della neuropile estranei a danno coltellate può anche verificarsi, ed è riconosciuto come neuropile holes del segnale di fondo di esemplari immunocolorate. I campioni con questi segni di degenerazione deve essere scartata (Figura 5C). Nelle nostre mani, il tasso di successo per la dissezione e lesioni nel controllo intatta e accoltellato (yw) mosche sono entrambi intorno al 70%. Questo tasso varia con l'abilità di chi esegue gli esperimenti, e con il genotipo. Figura 1. Schema di disegno di larve di sosta e accoltellato lesioni. (A) al giorno 0, mosche possono deporre le uova in una capsula di Petri succo d'uva per 3 ore. Al giorno 1, il tratteggio larve primo stadio (L1) vengono raccolti e collocati in fiale contenenti cibo standard lievito, dove sono conservati per altri 3 giorni. Al giorno 4, le larve vengono raccolti dalla fiala cibo, e utilizzati per gli esperimenti lancinanti. (B) Vista laterale della larva sistema nervoso centrale.La regione addominale del cordone nervoso ventrale viene pugnalato con un ago dal lato dorsale. Anteriore è a sinistra, posteriore e verso destra. Figura 2. Time-lapse progressione della lesione VNC. Microscopia confocale in vivo con VNCs assoni GFP-etichettati e DsRed-etichettati cellule gliali. Genotipo:. UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / + (A) La lesione è riconosciuta dalla mancanza di fluorescenza sul neuropile assonale. Dopo aver accoltellato, GFP-negativi fori appaiono, poi aumentando in dimensioni e numero. Proiezioni su 5 sezioni ottiche da ogni punto dopo accoltellamento infortunio. (B) Gli assoni si restringe lesione neuropile di 9 ore dopo l'accoltellamento. Queste immagini sono singole sezioni ottiche di diversi tempi dopo l'accoltellamento infortunio. Per identificare posizioni equivalenti in ogni campione, il numero di slice stesso da EAtempo punto ch nella pila di time-lapse dei dati è stato scelto. Confrontando i modelli visualizzati con G9 e repoGAL4> UASmCD8GFP nella zona non interessata dal l'accoltellamento, le fette sono state verificate come da posizioni equivalenti nel asse Z. Linee tratteggiate in (A, B) indica il bordo della ferita. (C) Alto ingrandimento ferite sul neuropile. GFP-negativi fori sono stati riempiti con i processi gliali DsRed-positivi, e successivamente scomparsa (punte di freccia). Vista orizzontale. Up anteriore. Figura 3. Caratterizzazione cellulare di lesione VNC. VNCs recanti un giornalista legato membrana GFP per tutte le cellule gliali (tranne glia linea mediana) colorati con anti-GFP e anti-GS2, una neuropile associata marcatore delle cellule gliali. Genotipo:. + / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / + (A) VNCs sono stati accoltellati da dorsal lato, ma questo causa una ammaccatura ventrale (punte di freccia). Vista sagittale di singole sezioni ottiche, dorsale sinistro e anteriore. (A, B) Stabbing pregiudizio colpisce più gravemente neuropile associata a cellule gliali rispetto alle cellule della corteccia e la superficie gliali. Risultati infortuni in GS2-positivo detriti cellulari (punte di freccia in B). (B) Vista orizzontale delle singole sezioni ottiche, fino anteriore. Frecce indicano GS2 + detriti cellulari. (C) Colocalisation del marcatore anti-apoptotico spaccati-caspasi-3 e il marcatore neuronale anti-Elav mostrando che al pregiudizio alcune delle cellule morenti nella corteccia sono neuroni. np, neuropile, cx, corteccia. Figura 4. Conteggio automatico delle cellule gliali e cellule apoptotiche con DeadEasy. (A) Esempio di utilizzo di 'glia DeadEasy larvale' contare REPO positivocellule gliali. A sinistra, la metà VNC ventrali colorate con anticorpi anti-pronti contro termine; medie: uscita da DeadEasy glia larvale nascondere le celle identificate dal plug-in, a destra si fondono. I numeri sulla destra sono il numero di REPO-positive cellule contate automaticamente in una pila di sezioni ottiche confocale in circa 30 secondi. Il numero di aumenti glia nei VNCs accoltellati. (B) Esempio di utilizzo di 'larva DeadEasy Caspase'. Proiezioni su 5 sezioni ottiche confocale colorate con anti-spaccati-caspasi 3 anticorpi; medie:: Sinistra uscita nascondere le celle identificate dal plug-in, a destra si fondono. I numeri sulla destra sono il numero di caspasi-positive cellule contate automaticamente in una pila di sezioni ottiche confocale in circa 30 secondi. Il numero di cellule apoptotiche aumenta nel pugnalato VNC. Figura 5. Esempi di degeneratione. (A) Un sano VNC. Non ci sono segni di degenerazione. (B) Il lato del torace sta degenerando (punte di freccia) in un campione accoltellato. L'asterisco indica luogo della lesione. (C) Fori nel neuropile toracica (freccia bianca) e la corteccia (arancione punta di freccia) in modo non pugnalato VNC. I campioni con danneggiato vacuolizzazione neuropile ed estesa deve essere eliminato. Qui VNCs sono state colorate con il pennarello neuropile associato gliale anti-Ebony. Vista orizzontale, fino anteriore.

Discussion

Abbiamo stabilito un protocollo per accoltellamento lesioni al sistema nervoso centrale larvali di Drosophila di indagare le risposte cellulari al danno, la riparazione e la rigenerazione. VNCs larvali sono sezionati e accoltellato, dopo di che sono realizzati con il time-lapse microscopia o fissato per immunostaining fluorescenza di visualizzare glia e neuroni, l'apoptosi o la divisione cellulare. La progressione della lesione nel tempo può essere misurato. Questo metodo è accompagnato da un software appositamente sviluppato per l'analisi quantitativa e statistica del numero cambia cellulare dopo lesioni e durante la riparazione.

Abbiamo pugnalato 96 ore larve AEL (e questi sono stati fissa o permesso di sviluppare ulteriormente), una fase di sviluppo prima del passaggio alla pupa e poi mosca adulta. A 96 ore, VNCs sono abbastanza grandi per accoltellamento, sono nel mezzo del terzo stadio instar, e quindi non sono sottoposti pupation ancora, e il sistema nervoso è già pienamente funzionale simile a quella dell'annuncioUlt. Potrebbe essere possibile per pugnalare un po 'più avanti in larve e la tempistica precisa deve essere scelto in funzione della domanda di ricerca. Tuttavia, a seconda delle questioni affrontate, sarà generalmente necessario per coltivare le VNCs per qualche tempo per osservare le risposte cellulari al danno. Qualche tempo dopo 120 ore inizio ninfosi AEL, un periodo in cui il sistema nervoso centrale è ristrutturato ed è quindi meglio evitare. Così la finestra temporale per aver accoltellato la cultura più nella larva è piuttosto limitato. Usando una larva ha ancora un grande vantaggio tecnico rispetto all'utilizzo di adulti: mentre, allo stesso modo per l'adulto, il sistema nervoso è già perfettamente funzionante, analizzando la risposta al danno è molto più facile e più veloce in larve.

Quando si confrontano le dimensioni e la morfologia del cervello e VNCs sezionati e coltivate in un piatto di VNCs che sono sezionate in un punto equivalente momento senza coltura in un piatto, sembra che lo sviluppo è più lento in coltura che in vivo. Sotto altri aspetti,sviluppo svolge normalmente in coltura, l'integrità dei tessuti viene conservato e le cellule sono vive mostrando risposte multiple. Espansione della ferita, la riparazione e la proliferazione gliale neuropile avvenire entro 22 ore post-accoltellamento. Questo dimostra che le risposte cellulari ad lesioni avvengono nella cultura e probabilmente esiste alcuna necessità di mantenere gli espianti per più di un giorno. Se la cultura a più lungo termine sono stati desiderati, il protocollo può richiedere un'ulteriore ottimizzazione come l'utilizzo di un inserto piastra di coltura 5.

È importante identificare i campioni di buona qualità da quelli degenerazione. Ottimizzazione questo protocollo richiede un po 'di abilità e, inevitabilmente, la degenerazione si verifica in alcuni esemplari. Il VNC può acquisire un aspetto 'cavolfiore' che riflette una ripartizione di integrità dei tessuti (Figura 5B). Degenerazione è riconosciuto anche dalla vacuolizzazione del VNC indipendentemente dal lancinante, che può essere presente in intatte, non accoltellati campioni (Figura 5C </strong>). Questi campioni devono essere scartati. La degenerazione è molto probabilmente causato da dissezione ruvida, che può strappare i nervi e lo strato protettivo della glia superficie. Così grande cura deve essere presa per analizzare delicatamente. Altri fattori che influenzano sono il terreno di coltura, che deve essere tenuto pulito e con gli antibiotici, attenendosi strettamente ai lavaggi e tempi come indicato nel protocollo. Infine, la lunghezza del supporto dell'ago e l'ago, la dimensione e la nitidezza dell'ago sono molto importanti. Il supporto dell'ago può contaminare il terreno di coltura e un ago smussato può causare lesioni di grandi dimensioni che non si ripara e porterà alla degenerazione. È importante mantenere normalmente l'ago appuntito.

In questo protocollo, abbiamo approfittato di una linea proteina trappola di mosche per visualizzare il neuropile in parallelo alla visualizzazione dei processi gliali con il tradizionale GAL4-UAS sistema. Questi strumenti possono anche essere combinati con altri sistemi di espressione binari come il LexA 19 e Q-system 20, che sono indipendenti GAL4. Ciò consentirebbe l'analisi delle interazioni per esempio tra assoni e processi gliali, in risposta al danno. Con ulteriormente combinazione con altri strumenti genetici come reporter per dendriti 21 o afflusso di calcio 22, questo metodo fornisce una grande opportunità per analizzare la biologia cellulare dietro la risposta lesione delle cellule gliali, gli assoni e dendriti neuronali nel SNC. Infine, questo metodo può essere combinato con standard di genetica, mutazioni e sovra-espressione di geni, per testare la funzione genica in risposta alle ferite e rigenerazione.

Questo protocollo è successo portato alla scoperta di una rete gene sottostante la risposta rigenerativa gliale a lesioni CNS 11. Data la conservazione evolutiva della funzione del gene, dipanando questi eventi cellulari e funzioni geniche in frutta mosche è tale da offrire spunti significativi nella comprensione della maCNS mmalian risposta al danno e la rigenerazione.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Ann Mei Lim per la lettura critica del manoscritto e di altri membri del nostro laboratorio per le loro discussioni in tutto il corso di questo lavoro. Questo lavoro è stato finanziato dalla Yamada Science Foundation e la Royal Society Borse Visita brevi e UE Marie Curie International Fellowship GRR arrivo per KK, e BBSRC Progetto Grant (BB/H002278/1) e Wellcome Trust attrezzature Grant (073228/Z/03/Z) a AH

Materials

      Equipment
Staining block Brunel Microscope    
Forceps No. 5 e.g. Fine Science Tools e.g. 11251-20  
Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch Roboz Surgical Instrument RS-6065  
Needle holder Roboz Surgical Instrument RS-6060  
Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps Fine Science Tools 29000-00  
35 mm Petri dish with 27 mm glass base Iwaki 3930-035  
Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber Leica    
      Reagent
Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) Sigma S3652-500 ml  
Penicillin and streptomycin Invitrogen 15070-063  
Phosphate-buffered saline (PBS) See 12    
FBS Sigma F7524  
Poly-L-lysin Sigma P1399-25mg  
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences 04018-1  
Mouse anti-glutamine synthetase antibodies Millipore MAB302  
Rabbit anti-GFP antibodies Life technologies A11122  
Mouse anti-REPO antibodies Developmental Studies Hybridoma bank 8D12  
Rat anti-ELAV antibodies Developmental Studies Hybridoma bank 7E8A10  
Rabbit anti-active caspase 3 antibodies Abcam ab13847  
Normal goat serum Vector Laboratories S-1000  
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 Life technologies A11034  
Anti-mouse Alexa Fluor 647 Life technologies A21236  
Anti-rat Alexa Fluor 647 Life technologies A21247  

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References

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Kato, K., Hidalgo, A. An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila. J. Vis. Exp. (73), e50306, doi:10.3791/50306 (2013).
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